磁共振成像评价移植干细胞治疗缺血性脑卒中疗效新进展

姚欣雨 曹振东 刘兰祥

移植干细胞是一类具有自我更新、且具分化能力的特殊细胞，能够通过细胞替代、营养作用、免疫调节等机制促进神经系统的功能恢复。移植干细胞包括从骨髓或脂肪、牙髓等组织来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)，来源于胎儿或者成人大脑的神经干细胞(neural stem cell，NSC)，从体外受精卵获得的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)，以及通过将重组基因引入体细胞获得的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPCS)。这些不同来源、不同类型的干细胞均可以用于治疗脑缺血、损伤或神经退化性疾病[1]。

在过去的数十年，以干细胞为基础的细胞疗法治疗缺血性脑卒中得到国内外的广泛关注和研究。1988年，Farber等人首次提出了移植细胞可以修复缺血性脑卒中损伤的观点[2]。2005年，Bang等人首次将自体间充质干细胞移植到5例脑卒中患者，随访1年，患者功能恢复改善，实验组巴氏指数与对照组相比差异具有统计学意义，并且一系列评估表明注射的实验组无细胞相关不良反应[3]，基于干细胞的治疗从而证实可以显著改善缺血性脑卒中患者的神经缺陷和日常活动[4]，为弄清干细胞在被植入脑内后是如何发挥作用的，急需一种影像技术对其进行活体内监测，对其疗效进行定性、定量的评估。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI) 技术由于具有可任意平面成像的三维采集成像、极高的时间分辨力和极佳的软组织分辨力、无电离辐射等优点，更重要的是能提供近细胞级分辨力影像等优势，使其在对干细胞移植治疗缺血性脑卒中的影像评价方面成为最有潜力的成像方式。

1 干细胞治疗脑卒中的机制

从理论上讲，缺血性脑卒中受影响的大脑可分为两个不同的受损区域，即缺血核心区和半暗区。由于缺血核心区的血流量低于细胞存活所需的阈值，其细胞被不可逆转地破坏、凋亡致无法挽救。相比之下，半暗区的血流量太低，无法支持神经功能，但提供了防止细胞立即死亡所需的最低能量，如果血流量及时恢复，脑细胞仍可以恢复。因此，目前干细胞移植的治疗策略包括在脑细胞死亡前挽救半暗区，或通过细胞移植[5]恢复新的神经网络。

干细胞治疗对急性、亚急性和慢性缺血性脑卒中的三个阶段都有效，如延长半暗期(急性期)，抑制非必要的炎症(亚急性期)，以及启动神经/血管生成(慢性期)[6]。移植细胞不仅能重组神经网络，还能减少局部和全身炎症，支持轴突再生和突触萌发，减少胶质瘢痕的形成。这些作用主要通过两种机制来实现：①细胞分化(细胞替代)。细胞替代可以通过将移植细胞分化为神经元细胞或血管细胞等来弥补失去的功能，也可以通过神经元祖细胞的直接定居和发育来实现[7-8]。②旁分泌因子(旁观者效应)。细胞分泌各种营养因子，如细胞因子、趋化因子和外泌体，可以改善神经损伤或再生新的神经回路[9-10]。除了促进抗炎和免疫调节作用外，这些因素还诱导抗凋亡作用，并调动内源性干细胞/神经祖细胞[11]。这些因子通过直接渗透或细胞外囊泡释放到周围环境中，并通过脾脏和胸腺等外周免疫器官直接改善缺血损伤，下调局部和全身炎症[12-13]。近来又有研究报告提出，恢复半球间双侧运动皮层连接可能是干细胞促进神经功能恢复的另一种机制[14]。

2 MRI对评价移植干细胞效果的应用

MRI可在干细胞移植时确认靶点，有效对移植入脑内的干细胞进行跟踪监测、显示其迁移，对脑组织在干细胞植入后出现的一系列组织形态学上的变化进行追踪，结合图像分析技术可以对脑组织形态进行更好的观察，一些特殊序列可对脑组织的血流灌注和代谢情况进行显示，从而评估干细胞对缺血性脑卒中的治疗疗效。

2.1 常规MRI对于局部脑组织变化的观测 众所周知，MRI是诊断缺血性脑卒中最有效的影像技术[15]，在CT出现可识别的低密度区之前，MRI常规扫描的弥散加权成像 (diffusion weighted imaging，DWI)序列以及据其计算出的表观弥散系数(apparent diffusion coefficient，ADC) 即可观察到明显的异常改变，精确定位缺血损伤区域以及其受累范围[16]。MRI可以在干细胞移植后对干细胞迁移、归巢等生物学行为进行观察，还可以同时对缺血损伤区的改变提供更多影像方面的信息，例如可对缺血损伤区域的大小和信号变化进行较直接的观察，还可通过对MRI图像进行不同的后处理、分析，对干细胞造成局部组织的变化可以更精准的观测与判断。

除了对缺血性脑卒中病灶的精确显示，MRI还可以在干细胞移植入脑内之后对其进行示踪的同时，通过图像分析可对缺血损伤区的范围、信号等变化程度进行高灵敏度的观测，从而对干细胞引起脑组织的变化进行有效的观察。由于常规MRI图像分析简便易行，不需要复杂的处理及运算，不仅可以在干细胞移植后不同时间点多次重复测量，还可以提供全脑整体的影像，从而发现一些可能引起远隔部位原发缺血损伤部位的异常改变，为干细胞治疗缺血性脑卒中机制的研究提供理论依据。

McGarry等人[17]的一篇实验报告指出，在常规MRI序列中，在相同的脑血流阈值下，脑缺血开始后数分钟内，DWI信号升高，ADC值急剧下降，而T2弛豫时间对脑卒中缺血受损的组织信号变化具有时间敏感度。

弥散张量成像(diffusion tensor imaging，DTI)是在DWI上发展出来的新型技术，其衍生的锥体束完整性的分数各向异性(fractional anisotropy，FA)测量最近被证明可以预测剩余的神经运动功能，即神经系统受到损伤后，预期可以通过治疗恢复达到的功能水平。然而，Yassi N等人指出[18]，这种测量的预测能力往往局限于特定的神经解剖部位，因此大大减少了其可靠预测的范围。

Spellicy SE等人通过探讨神经干细胞外囊泡对缺血性脑卒中的疗效[19]进行了一系列的参数研究，通过在MRI上的轴位、冠状位对中线的移位程度进行测量，提示：中线移位(MLS)程度与所记录的实验对象步态和行为等参数具有最高的显著相关性，支持将中线移位作为一种可靠、有效、转化和预测功能恢复的指标，认为该指标可以通过与已建立的功能相关性的差异来评估干细胞治疗的临床疗效。

最近Leftin A等人的一项研究提出[20]，在高场强下，不同的MRI图像参数的纵向行为及对于干细胞治疗后缺血性脑卒中恢复效果的诊断存在差异，根据ADC所反映的水肿和肿胀恢复的时间，能够提供较为准确的信息，表明ADC对缺血的恢复反映最为灵敏。

2.2 常规MRI对移植干细胞的监测 为了明确干细胞移植入脑内后的一系列生物学行为，很重要的一项任务是需要对其进行监测。对外源性移植干细胞的监测传统的方法依赖于组织病理学，这种方法具有侵袭性，需要进行制备切片和观察免疫组化染色结果。在动物实验研究中需要处死动物还不足以揭示移植细胞在宿主活体组织中的迁移和命运，因此，存在着很大的限制。在临床上我们需要一种非侵入性的方法，可以提供注射后细胞的功能、生存能力和运输数据[21]，为满足这种需求，分子影像技术被提出并得到进一步发展。MRI由于具有高空间分辨率的特性，使得它成为活体内监测移植干细胞最有效的方式。

最近许多研究聚焦于探索移植干细胞更好的追踪效果。如2019年，胡越等人[22]利用生物发光成像(bioluminescence，BLI)与MRI相互结合的方式追踪移植入大鼠肝脏内的间充质干细胞，发现在移植术后，移植区域的生物发光信号显著增强，然后随时间逐渐下降，MR信号也随之下降，由此证明了二者对于活体内移植干细胞示踪的确定意义。2020年杜磊等人[23]的一项实验开发用聚乙二醇/聚乙烯亚胺修饰SPIO标记的移植脂肪源性干细胞治疗阿尔茨海默病MRI活体示踪的可行性，标记的细胞可以在MRI上清晰地观测到呈低信号，而标记组与非标记组的水迷宫逃避潜伏时间无统计学差异，也证明了其安全性。

另有一项Piotr Walczak等人的研究[24]表明，基于GE-EPI脉冲序列的高速MRI也可用于实时监测经动脉输注到中枢神经系统的干细胞。MRI引导不仅可以很好地提高动脉灌注基础的血脑屏障开放和化疗药物给药的精确性，还能够预测干细胞的归宿、验证经动脉细胞输注后血管的通畅性，此种方式还允许将干细胞经动脉高度精确的灌注到中枢神经系统，这种方法对于干细胞灌注的实时成像至关重要。该项研究展示了这项技术在大型动物的可行性，也证明了临床的可译性。

2.3 MRI图像分析技术的应用 MRI常规序列能够提供的信息相对有限，而通过一些图像分析技术对常规MRI所得图像进一步的分析，可以获得更多的信息。2017年，Rui He等人提出一种基于MRI的图像分析技术[25]——参数响应图(parametric response map，PRM)，这是一种基于体素的分析技术，在多参数MRI图中应用。这种技术已用于分析包括胶质瘤和原发性脑出血在内的多种脑疾病。PRM是一种很有前途的工具，可以在体素水平上研究异质性病变(如缺血性脑卒中等疾病)随时间的参数变化，用来评估治疗效果。治疗1 d后，PRM分析即能够判断出MSCs诱导的细胞水肿、微血管可塑性和血管扩张的变化。而经典的全损伤方法无法评估这些早期治疗效果。PRM方法也能显示病变内不同位置、不同时间点发生的改变。因此，这种算法能够较为灵敏地评价干细胞植入脑内后造成的局部组织变化程度。

2019 年，Guangming Zhu 等 人 使 用 一 种 基 于DWI MRI的血管内非相干运动(intravoxel incoherent motion，IVIM)，通过多b值序列测量微血管灌注[26]，IVIM可以类似于MR灌注成像来评价缺血性脑卒中，首先需要通过DWI来确定缺血核心，继而通过IVIM f或IVIM fD*来勾画出半暗带。2020年，Asit Subudhi等人[27]提出了一种基于计算机辅助决策系统、以及MR图像序列弥散加权图像(DWI)的缺血性脑卒中自动检测方法，利用期望最大化算法对脑卒中影响区域进行分割，并利用分数阶达尔文粒子群算法对分割区域进行进一步处理，以提高检测精度。这种计算方法可以精确地对缺血受累区域划分，在报告的192次MRI扫描中准确率达到93.4%，为干细胞的治疗提供决策，也可以对治疗后的脑组织缺血损伤程度及代谢情况进行判断。

最近，Richard E等人提出一种临床可翻译MRI算法[28]——分级区域分割算法，这种算法提供了一种严格、快速、前瞻性、非侵入性的方法，用于识别具有对NSCs神经保护作用机制有反应的损伤部分。植入的NSCs只有在存在核磁共振可测量的半暗带时才能改善受损、运动和/或认知结果，从而阻止其演变为坏死的核心；而缺血核心的损坏是不可逆的，无法得到改善。因为与缺血核心不同，半暗带的分子结构是可以抢救的。这种算法也提示，只有半暗带核心的损伤区域才有使用细胞治疗的意义，这样的测量方法也引起了再生医学领域的一些讨论。

2.4 MRI的特殊序列的应用 干细胞移植作为一种治疗缺血性脑卒中有前途的细胞疗法，其临床疗效作用的评价十分重要，除了必要的神经功能评分等临床评价，影像评估能更加为干细胞及其对脑组织的影响提供信息，从而对疗效进行判断。除了常规MRI的T1、T2、DWI等序列对于干细胞移植治疗缺血性脑卒中影像的评价，一些基于MRI的特殊序列也不同程度地、直接或间接地反映了移植干细胞及脑组织的变化。

例如，磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging，SWI) 序列可以对磁性粒子标记干细胞连续、无创地追踪和显示，还可以敏感地显示微出血、间接显示干细胞的迁移路径；灌注成像序列(perfusion weighted imaging，PWI) 可以显示脑组织的血流灌注情况，精确地反映干细胞植入前、后脑组织的实时存活情况。赵琪等人在一篇实验报告中指出，灌注加权成像序列对于急性缺血性脑卒中预后有着很高的诊断价值[29]，灌注成像的脑血流流量界值为5.90 mL/(100 g·min)时，预测预后良好的敏感度为73.3%，特异度为87.5%；当ADC界值为0.42×10-3mm2/s时，预测预后良好的敏感度为74.3%，特异度75.0%；波谱分析成像(magnetic resonance spectrum，MRS)序列可显示损伤灶及周围脑组织的代谢，从而反应其活力，例如张冰等人[30]发现，在脑卒中后的3 h即可测到升高的乳酸峰。2020年，Ahmed A Khalil等人发现血氧水平依赖性(BOLD)信号振荡的相对延迟可以在MRI不使用造影剂的情况下评估脑灌注的变化[31]，从而成为对脑卒中细胞疗法疗效的评价方式。

2.5 使用磁性纳米颗粒对干细胞进行标记 使用超顺磁性化铁颗粒 (super paramagnetic iron oxide，SPIO)对干细胞进行标记，是常规MRI监测移植干细胞最广泛使用的方法。SPIO是MRI在干细胞标记监测中的首选材料，并且在国内外已经被广泛地研究。SPIO对细胞进行标记不会影响其增生、分化能力，这一点在国内外诸多实验中已经得到了证实。SPIO可以在生物体内通过铁代谢途径安全降解，一些SPIO早在近20年前就已经被美国FDA批准用于人体[32]。标记的方式有两种，即：①将氧化铁颗粒直接注入大脑或脑室，原位标记增生的干细胞。②用氧化铁颗粒在体外标记细胞，然后移植到大脑或血管系统内[33]。MRI常规平扫的所有序列均可显示局部移植的标记干细胞，而梯度回波序列最为敏感，SPIO标记的干细胞由于其顺磁性而呈低信号。脑的局部缺血、损伤等局部微环境可以通过趋化作用使植入干细胞按时间顺序迁移至损伤区域，这一点可以通过对SPIO标记的NSC进行的T2*加权MRI扫描清晰地被观测到，如2019年Jiang Lili等人[34]所发现，随着时间的推移，注射点代表植入干细胞的低信号向损伤区域迁移，这与紧接着进行的H-E染色、普鲁士蓝染色显示的细胞分布结果一致。2020年，Guangtian Wang等人的一项研究[35]发现移植干细胞通过胼胝体定向归巢到缺血损伤组织，利用荧光成像进行体内追踪，荧光信号呈进行性下降，在移植3周内由100%下降至25%，表明移植的干细胞逐渐迁移到梗死侧，该研究结果也与之前Jiang Lili等人研究所述结果一致[34]。

3 其他成像方式的应用

除了MRI以外，还有一些分子成像技术可以应用于追踪移植干细胞及对其疗效进行影像评价，例如基于同位素示踪原理显像的单光子计算机断层成像(SPECT)、正电子发射断层显像(PET)，以及利用荧光物质、荧光蛋白或者荧光素酶等进行标记从而显像的光成像技术等，均可以对标记的移植干细胞进行追踪，这些成像方式与MRI相比，检测的灵敏度均较MRI高，但是检测的分辨率远不及MRI。这些成像方式对于脑组织的形态学，代谢情况改变也可以提供不同程度的信息。

4 MRI应用于干细胞疗效评价的局限性

MRI在这方面也存在着一些局限性，例如基于直接细胞标记的细胞MRI非常适合于实时、磁共振引导的干细胞输送以及细胞移植的即时监测，SPIO标记干细胞在MRI上呈现的低信号体积的动态变化可以反映细胞存活和凋亡的趋势，但可能由于移植细胞周围存在含铁巨噬细胞而高估了细胞的长期存活从而造成假阳性，影响结果的精确度[36]。其次，MRI成像十分依赖于设备和各项参数，如果条件受到限制而无法达到最佳配置，将会对结果产生较大的影响。除此之外，成像速度也会受到一定程度的限制。

5 未来的发展趋势与展望

按照目前的研究形势来看，干细胞移植进入脑内后的生物学行为尚未完全清晰，通过多种机制而造成的脑组织改变也尚无较为统一的标准。许多研究致力于寻找在体内追踪标记干细胞更有效的方式，包括基因转导细胞、分子探针的开发应用、合适的颗粒涂层等，而更具有临床应用性、关注脑组织细微的形态学和代谢改变者相对较少。因此，在对干细胞进行示踪的同时，以精确、灵敏显示脑组织变化的研究将会得到开展。在这种需求下，为了对干细胞疗效进行更充分的评价，在未来多种成像方式相互结合、互相取长补短的多模态成像将是必然的发展趋势。