骨碎补在骨重建中作用的研究进展

范佳俊 陈烽 高威 陈哲*

310005 浙江中医药大学附属第二医院（陈哲）

骨碎补为槲蕨科槲蕨属植物的干燥根茎，味苦，性温，归肝、肾经，具有补肾强骨、续伤止痛、活血散瘀的功效。自古在中医广泛用于治疗跌扑闪挫、筋骨折伤、骨质缺损、牙齿松动等症。骨骼作为动态的活性组织，通过持续旧骨吸收和新骨形成修复损伤、维持自身完整的生理结构及骨量平衡的过程称为骨重建。现代中医研究及西医临床研究已经证明骨碎补在骨质疏松及骨折愈合中促骨形成的骨重建作用。柚皮苷是骨碎补的主要活性成分［1］，是经提炼、纯化得到的一种单体物质。其传承骨碎补的药用价值，在西医基础研究中展现出在骨缺损修复重建方面的潜力。

1 中医研究现状

从《黄帝内经》的“肾主骨”之说，到《素问》指出的“肾之和骨也，主骨生髓，在体为骨。肾者，精之所处，其充在骨”。中医学历来认为“肾藏精，主骨生髓，滋养骨骼，骨的生成需要肾气推动、肾精滋养”。骨碎补属于补肾强骨、益精补髓的中药，《本草新编》曰“入骨，用之以补接伤碎最神”。马晓飞等［2］对97例患者应用以骨碎补为君药的活血益骨汤进行脊柱骨折术后促骨折愈合的治疗，实验组患者在缓解术后骨折部位疼痛及骨折愈合方面的有效率较对照组提高15%。王宝峰［3］对93例患者应用以骨碎补为君药的健骨益肾方，对脊柱骨折行手术加药物的联合治疗，健骨益肾方可显著提升患者血清骨钙素、碱性磷酸酶水平，改善视觉模拟评分（VAS）及Oswestry功能障碍指数（ODI评分），促进骨折愈合。关一等［4］报道椎弓根螺钉内固定联合加味复元活血汤治疗胸腰椎骨折，患者住院时间更少、骨折愈合时间明显缩短，术后随访显示远期疗效可靠、持久、安全。陈勍等［5］使用强骨饮对120例股骨粗隆间骨折术后患者进行骨重建治疗，随访显示实验组患者对侧股骨粗隆再发骨折发生率明显下降，有效降低骨折风险。

骨质疏松症在中医属“骨痿”范畴。《临证指南医案·瘘》指出：“肾藏精，精生血，血虚则筋骨失养”。肾精亏损，则骨骼失其所养，髓虚而骨枯，然发骨病，发为骨痿。《素问·痿论篇》云：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”。“肾者，水脏也。金水不能胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿”。中医学认为骨质疏松症主要与肾脏的盛衰有关。多因肾虚、气血瘀滞导致，肾虚为发病之本，血瘀为发病之标，可以采用“补肾填精”的方法治疗骨质疏松患者。段晓栋［6］应用益肾壮骨汤，方中以骨碎补补肾活血、止痛续伤为君药，对患者行抗骨质疏松治疗，治疗后患者骨密度明显提升。强骨饮方中以骨碎补主补肾强骨，辅以其他药物活血通络、补益气血，应用于抗骨质疏松治疗中，有降低骨吸收率［7］、改善骨密度、缓解骨质疏松性疼痛等作用［8］。

2 西医研究现状

2.1 西医临床研究 骨折是常见的骨科疾病，骨折延迟愈合、骨不连是其严重并发症［9］。MILLS等［10］调查发现，每年每1000例人口中会有23.2例发生骨折事件，骨折后发生不愈合风险为1.9%。骨不连发生率及数量在不同年龄、性别及骨折部位间存在明显差异，有向年轻化发展的不良趋势。叶灵超等［11］对108例骨折延迟愈合患者行骨碎补注射液肌注治疗，实验组患者血清中碱性磷酸酶、神经生长因子和骨形态发生蛋白-2水平治疗后显著提升，与对照组比差异有统计学意义，同时骨折延迟愈合患者的治疗有效率也显著提升。

骨质疏松症常发生于中老年人，特点是骨微结构破坏，骨密度和质量下降，骨脆性增加。骨碎补在西医临床上已被制作成成品药物强骨胶囊广泛使用。秦础强等［12］使用强骨胶囊治疗慢性阻塞性肺疾病合并骨质疏松症患者，治疗后患者L1～4椎体及左侧股骨颈骨密度得到提升，躯体疼痛VAS评分及ODI评分明显改善。调查研究显示［13］，我国中老年人骨质疏松症总体患病率约23%，其中男性患病率约16%，女性在绝经后骨质流失率是男性的2～10倍［14］，患病率约27%。长期骨质疏松且不加以骨重建干预，最终会引起骨质疏松性骨折，尤其是髋部骨折和椎骨骨折，是导致老年人残疾、死亡的重要原因［15］。在治疗骨质疏松性椎体骨折患者的策略上，经皮椎体成形术（PVP）被认为是一种见效快、风险小、患者满意度高的微创手段［16］。但从远期疗效考虑，抗骨质疏松治疗是更为重要的后续保障。谢占成［17］对绝经后骨质疏松性椎体压缩性骨折PVP术后患者使用强骨胶囊进行抗骨质疏松治疗，治疗6个月后患者髋部及腰椎骨密度明显提升，血清钙、磷含量下降，碱性磷酸酶水平上升，PVP术后患者躯体疼痛症状进一步获得改善。老年患者长期使用骨碎补并未出现肝、肾功能异常，同时药物不良反应发生率低，表现出强骨胶囊优异的安全性。此外，荟萃分析显示强骨胶囊拥有不亚于常规药物如：活性维生素D3、阿仑磷酸钠、钙尔奇D、雌激素、骨化三醇胶丸等抗骨质疏松疗效，且安全性更佳［18］。

2.2 西医基础研究 （1）柚皮苷对骨髓间充质干细胞作用：柚皮苷是骨碎补的主要活性成分，是经提炼、纯化后得到的一种单体物质。柚皮苷可以通过促进骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化，促进成骨细胞增殖、分化、矿化参与骨形成，抑制破骨细胞活性并减少骨吸收［19］。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是存在于骨髓基质中具有分化为成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞等多种细胞亚群的干细胞。BMSCs在体内增殖并分化形成骨骼的能力使其成为再生医学中重建骨骼的一种极具研究潜力的细胞［20］。现阶段对于BMSCs的研究主要细胞实验中进行，1～100 μg/ml的柚皮苷溶液干预能增强人BMSCs的增殖，通过激活ERK信号通路，促进成骨相关标志物（ALP、Runx2、Osterix、骨钙素和I型胶原蛋白）表达［21］，促进BMSCs成骨分化，加速矿物质积累，诱导钙结节形成，浓度>200 μg/ml可能会对细胞产生毒性作用［22］。对于不同来源的BMSCs，柚皮苷的效应浓度也不尽相同。在大鼠BMSCs中，最佳浓度为10-5～10-6mol/L［23］，柚皮苷上调β-catenin、LRP5、Runx2及Osterix等相关蛋白的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进成骨分化［24］。MAPK、ERK、Notch、IHH以及JNK信号通路等也可能参与其中［25］。在兔BMSCs中柚皮苷效应浓度<10-4mol/L［26］，在犬BMSCs中为10-6～10-7mol/L［27］，均促进BMSCs成骨分化和钙盐沉积，还有学者认为柚皮苷的有效作用浓度在10-9～10-4mol/L［28］。（2）柚皮苷对成骨细胞作用：成骨细胞是由骨髓间充质干细胞分化而来。成熟后的成骨细胞呈单层排列覆盖于骨表面，分泌骨胶原，合成骨基质，释放钙离子使骨组织钙化，直接影响着骨的形成和重建。细胞实验中，柚皮苷作用下培养原代成骨细胞，测量显示碱性磷酸酶活性增高，成骨细胞数量增多，骨钙素、骨桥蛋白分泌增多，茜素红染色可见钙化结节形成［29］。徐高丽等［30］发现柚皮苷在促进成骨细胞增殖的同时，也增强其分泌I型胶原蛋白。有研究认为，这可能与柚皮苷激活PI3K/Akt、ERK1/2信号通路，缩短成骨细胞增殖的细胞周期时间，同时使处于S期的细胞比例增高，处于凋亡期的比例下降［31］。翟远坤等［32］认为柚皮苷也通过雌激素信号通路，促进成骨相关因子如：碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、Runx2、Osterix和雌激素受体（ER）ERα及βmRNA的表达，增强成骨细胞促骨形成作用。KUANG等［33］研究发现柚皮苷在激活Akt信号通路促进成骨细胞和骨细胞增殖同时，还可以抑制Bad信号通路抑制骨细胞凋亡和破骨细胞生成。AMPK信号通路亦可能与之有关［34］。柚皮苷对成骨细胞的作用同样存在浓度依赖性，浓度范围从10～1000 μmmol/L，对成骨细胞增殖作用先增强后减弱，100 μmmol/L是最佳作用浓度也被众多研究认同和采用［30］。动物实验中，袁毅等［35］应用柚皮苷治疗大鼠股骨骨折，Micro-CT结果显示骨折断端由近到远5 mm范围内骨矿物质含量、骨体积分数明显增高，DR片检查显示柚皮苷组大鼠股骨骨折线消失更早，断端骨痂生长速度更快，骨愈合所需时间明显缩短。孙道喜［36］用不同浓度柚皮苷治疗骨质疏松性骨折大鼠发现，1～100 mg/kg柚皮苷呈剂量依赖性促进骨折区成骨细胞增殖、分化，加速原始骨小梁向成熟骨小梁改建，最大程度恢复骨质疏松性骨折骨痂的最大载荷。WANG等［37］用柚皮苷治疗去卵巢骨质疏松小鼠，测量小鼠股骨远端、胫骨近端和腰1椎体三处骨密度均显示小鼠骨密度明显改善，阻断小鼠骨骼生物力学骨强度的下降。黄俊波等［38］用柚皮苷治疗兔双侧股骨髁间窝骨软骨缺损，治疗6个月后可见新生软骨完全覆盖缺损并与周围正常软骨组织产生融合，缺损处组织中II型胶原蛋白表达量明显增高。张镝等［39］研究亦证实柚皮苷能促进大鼠股骨干骨缺损的修复重建。（3）柚皮苷对破骨细胞作用：破骨细胞在人体主要发挥骨吸收功能，与成骨细胞功能相对应。破骨细胞的活性决定骨的净流失量。RANK/RANKL/OPG轴是调节骨形成和骨吸收的重要信号通路，对破骨细胞的影响尤为重要。RANK表达于破骨细胞表面，RANKL与之结合可以触发TRAF6，随后激活下游NF-κB和MAPKs信号通路，改变c-fos、NFATc1和c-Jun的表达，促进破骨细胞及其前体细胞的分化与形成［40］。OPG可通过占位效应阻止RANKL与RANK结合，防止骨的过度吸收。细胞实验中，由RANKL诱导单核细胞（RAW264.7）分化为成熟破骨细胞的过程中，柚皮苷通过下调RANK、TRAP、NFATc1的表达，上调c-fos的表达，抑制破骨细胞增殖、分化及骨吸收功能，使破骨细胞在薄骨片上的骨吸收陷窝数及吸收总面积大幅下降［41］。ANG等［42］报道，柚皮苷还可以抑制RANKL诱导的NF-κB和ERK的活化，进而抑制破骨细胞的形成和骨吸收功能。且破骨细胞与成骨细胞也存在微妙的关系，当破骨细胞分泌的RANK与成骨细胞表面RANKL相结合，可以触发RANKL反向信号传导激活Runx2，从而激活成骨细胞功能促进骨形成［43］。XU等［44］发现在100 mg/L的浓度下柚皮苷可以发挥最佳效应，通过上调OPG表达，使OPG/RANKL比例增加，从而抑制破骨细胞增殖及分化。同时，成骨细胞分泌的OPG也可以反作用于破骨细胞，抑制其骨吸收功能。此外，柚皮苷还通过激活线粒体凋亡途径促进破骨细胞凋亡［45］。动物实验中，李念虎等［46］研究报道，全关节置换术后骨组织与内植物之间产生的磨屑会引起假体周围骨溶解及骨丢失，最终导致内植物松动关节置换失败。采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）颗粒模拟碎屑，诱发小鼠模型中破骨细胞性骨溶解，并使用150 mg/kg剂量柚皮苷治疗。柚皮苷治疗组明显降低模型中TRAP（+）破骨细胞数量，减少1.5倍的钙释放及22%的骨胶原丢失。徐展望等［47］也采用柚皮苷治疗PMMA颗粒诱发的小鼠膝钉模型的骨吸收，发现柚皮苷治疗组胫骨近端植入钉周围单位体积内骨量是对照组的3倍，拔出植入钉的平均界面剪力峰是对照组的2.5倍。（4）柚皮苷与生物材料的结合应用： 柚皮苷在临床中应用不仅仅是其本身的单独应用，还有以各种支架材料作为载体的结合应用。LAI等［48］设计制造的具有生物活性的钛基生物材料TiO2纳米管可以做到可控的缓释柚皮苷，使柚皮苷对局部促骨形成作用保持在一个最佳浓度范围及持久的作用时间。CHEN等［49］发现由明胶、β-磷酸三钙、磷酸和柚皮苷组成的GGTN复合材料在骨移植中展现出较好的骨缺损修复能力，兔颅骨缺损区有大量新骨长入。WONG等［50］发现柚皮苷联合胶原蛋白基质作兔颅骨缺损骨移植，其移植后骨形成效果优于自体骨及单纯胶原蛋白基质。

3 展望

不管是在中医临床上作为君药配伍其他药材组合为汤剂，还是西医临床上的成品药物强骨胶囊，骨碎补已被广泛应用并展现其抗骨质疏松和促骨折愈合的骨重建作用。骨碎补在骨重建过程中发挥着促骨形成，抑制骨吸收的总体效应。鉴于骨碎补在基础研究中被发掘出来的骨缺损修复重建的潜力，以后可能应用于大段骨缺损修复。现有研究中，作为复合材料的胶原蛋白基质降解过快，无法匹配新生骨爬行替代的速率；GGTN可能存在生物相容性问题；TiO2纳米管由于钛的天然生物惰性，实现早期骨整合是其缺陷。因此，为了更好发挥骨碎补的骨重建特性，兼具生物相容性、植入安全性及合适降解速率的生物材料支架将是下一步研究的重点。