3H与14C放射性标记化合物发展现状

黄 伟，陈宝军，赵思倩

(中国原子能科学研究院，北京 102413)

放射性标记化合物是指用放射性核素取代分子的一种或几种原子，使之能被放射性探测技术识别用作示踪剂的化合物。采用放射性标记化合物的示踪检测技术，具有灵敏度高、干扰少、方法简便、准确性好等优点，在研究物质分布、揭示反应机制、阐明迁移过程、微量物质分析、生物活性测定、医学临床诊断等方面扮演着重要的角色，已广泛地应用在工业、农业、医学及科学研究的各个领域[1-4]。用于制备放射性标记化合物的放射性核素主要有3H、14C、32P、35S、125I等。3H是纯β衰变核素，主要β射线能量18.6 KeV，半衰期12.3年，3H标记化合物具有高比活度的特点。14C也是纯β衰变核素，主要β射线能量156 KeV，半衰期5 730年，在空气中的最大射程为22 cm。3H与14C标记化合物作为示踪剂具有半衰期长，应用时不需要考虑衰变校正，放射性能量低因而防护容易，对操作人员辐射损伤小；毒性低、检测灵敏度高等优点。3H与14C还是生命元素的同位素，在制备标记化合物时不会影响该化合物的生物活性。由于3H与14C标记化合物具有的诸多优点，因而广泛地应用于生物技术、医药开发、农业、工业等领域。随着国家新药创新研究的开展，对3H与14C标记化合物的需求也在日渐增加。本文总结3H与14C标记化合物制备方法，分析应用领域，回顾国内发展情况，希望能促进3H与14C标记化合物的发展，满足国内科学研究对放射性标记化合物的需求。

1 3H与14C标记化合物的制备

1.1 3H标记化合物的制备

根据3H在标记分子中的位置是否确定，3H标记化合物的制备方法分可为定位标记和非定位标记两类。非定位标记是3H在标记分子中的标记位置不固定的一类标记方法，而将3H局限于标记分子中指定位置的标记方法则为定位标记。非定位标记主要是通过同位素交换方法实现3H标记化合物的制备，标记过程简便，对标记前体没有特殊要求，几乎可以实现所有含H化合物的3H标记。通过非定位标记制备的3H标记化合物一般比活度较低，3H在标记物的位置无法预先确定，一般用于对标记位置要求不高或其他标记方法无法实现的情况。

3H标记化合物的非定位制备方法主要有氚气曝晒法、酸碱催化的同位素交换、金属催化的同位素交换等[5]。氚气曝晒法以3H2为原料，通过将标记底物放置在氚气中直接H/3H交换进行标记，制备的3H标记化合物比活度低，放射性杂质多，目前已基本不再采用这种标记方法[5]。同位素交换法制备3H标记化合物更多是在催化剂条件下进行，应用的催化剂主要有Pd、Ir和Rh等贵金属催化剂[5-6]，制备的3H标记化合物有芳香族化合物、碳氢化合物及核酸等。为促进同位素交换反应的进行，Ghanem等[7]提出了微波放电激活标记的方法，后经过改进完善成为一种有效的氚标记方法。这种氚标记方法通过对反应物施加微波激活，缩短了反应时间，同时还具有消耗氚气少、标记产物比活度较高、杂质少、易纯化、操作相对简便等优点，这种方法适用于氨基酸、多肽、蛋白质等多种类化合物的标记。沈德存等[8]应用微波放电激活标记的方法研究制备了氚标记的环磷酸腺昔、皋丸酮等化合物。在金属催化的同位素交换法标记基础上，Myasoedov[9-10]等研究开发出了高温固相催化同位素交换技术，固相反应以惰性化合物为载体(如碳、硫酸钡、碳酸钙、氧化铝等)，将催化剂和反应底物覆盖到固相载体上，在3H气中加热反应，反应温度在100～200 ℃，反应时间在几个小时以内。他们应用高温固相催化同位素交换技术合成了雌酮、十六烷、反式玉米素等多种氚标记化合物，3H标记化合物的比活度在12.5～75.6 Ci/mmol。他们的研究表明，通过固相合成技术进行3H标记，标记效率与标记的有机化合物的熔点有关，低熔点化合物与高熔点化合物在固相催化同位素交换反应过程中的动力学不同。高熔点化合物在反应过程中随着时间增加，标记效率会有一个平台，而低熔点化合物在标记过程中随着反应时间的增加会有一个峰值。高温固相催化同位素交换相比在液相条件下的催化同位素交换方法所需反应时间短、标记物比活度高，但这种方法不适用于热不稳定的标记底物。

3H标记化合物的定位制备方法主要是通过化学合成反应实现，包括氚卤置换反应，氚气还原不饱和键，金属氚化物的还原，烷基金属的氚水解等[6]。通过化学合成进行氚的定位标记一般所需的反应步骤较多，或对标记底物具有一定要求，如需先制备标记底物的卤代物作为标记前体、标记底物中有适于加成的双键或可以通过氢及氢化物还原的基团等。研究新的更简便氚定位标记的方法主要有：(1)催化剂诱导控制3H标记位置；(2)溶剂诱导控制3H标记位置；(3)标记底物诱导控制3H标记位置。对同一个3H标记反应，使用不同的催化剂可以将3H定位标记到目标化合物的不同位置上。

Loh[11]等采用光引发的氢原子转移(HAT)策略完成了三级胺氨基α位C(sp3)-H键的选择性氚代研究，反应在Ir(Ⅲ)催化剂或有机分子催化剂1,2,3,5-四(咔唑-9-基)-4,6-二氰基苯(4Cz-IPN)的作用下，以硫醇作为HAT催化剂，采用廉价易得的T2O作为氢同位素来源便可实现以上过程。他们利用该方法在18种不同药物分子中选择性标记氚，标记物可以满足药代动力学研究的需求，实现了有效地、有选择性地在a-氨基sp3碳-氢键一步标记氚。

Bokatzian-johnson[12]等系统研究了超声和微波在3H标记糖类时的应用，开发出了选择性的将3H标记到非还原性的糖或糖偶联物上的方法。他们的研究发现，将催化剂经超声处理，不论是在反应前还是在反应过程中，都会改善3H标记在室温或更低温度反应条件下的选择性和反应速率。研究发现大部分的有机官能团(酮、酯、羧酸)在超声条件下都会接受兰尼镍类型的催化剂。而一些典型常用的催化剂如Pd/C催化剂或者单独的金属镍催化剂则不起作用。二相或三相混合金属催化剂(如Ni-Al)则没有催化效果。溶剂的种类以及反应底物上OH-或NH-上的保护基团的不同都会对3H标记的位置产生影响。

Zolotarev[10]等在研究高温固相催化同位素交换反应时发现，当底物上有易还原基团(如硝基、双键等)，通过控制标记条件就可能在这些还原基团上进行选择性标记，标记的位置与3H的气体压力、反应温度、选择的催化剂有关。

1.2 14C标记化合物的制备

14C标记化合物主要都是通过化学合成法进行制备[6]，以Ba14CO3为起始原料，一般通过三种反应途径实现14C 在不同位置的标记化合物。一是Ba14CO3加酸生成14CO2后与格氏试剂反应制备14C在羧基上的脂肪酸或芳香酸等一系列化合物；二是Ba14CO3经过金属镁还原生成Ba14C，水解后生成乙炔再经过环合反应后生成14C标记位置在苯环上的一系列化合物；三是还原成为K14CN，再卤化物发生取代反应生成含14C标记的胺类化合物、氨基酸、嘌呤及嘧啶等标记化合物。

目前应用的14C标记化合物大部分都是通过上述合成方法制备，所需反应步骤较多，标记过程比较复杂。为了开发更简便的14C标记化合物制备方法，Kingston[13]小组参考同位素交换法进行氚标记的策略，提出了一种类似的12C/14C交换的方法实现烷基羧酸的14C放射性标记。烷基羧酸的反应底物首先在镍催化剂作用下与羟基邻苯二甲酰亚胺形成氧化还原活性酯，然后在镍催化作用下形成脱去羧基的中间体，该中间体与反应体系中的14CO2结合重新形成烷基羧酸。该方法已在20多个底物上进行了标记应用，放射性比活度最高可达到66 μCi/mg，较化学合成方法制备的14C标记化合物比活度低很多，但已经能用于多种药物代谢和药代动力学研究。该方法用于含羧酸化合物的高效14C放射性标记，12C/14C同位素交换在概念上类似于H/T同位素交换，是一种方便和操作简单的14C标记方法，这些方法避免了多步的合成。通过在多个14C放射性标记反应中的应用，证明了该方法的实用性和操作简便性，也为开发其他新的简便14C标记方法提供了思路。

2 3H与14C标记化合物国内发展情况

上世纪七十年代，中国原子能科学研究院开展3H和14C标记化合物的研制，建立了标记化合物研究实验室，形成了气体爆射法、氚卤交换法和微波标记法等多种核素标记方法，研制出3H、14C标记的近百种标记化合物[7,14]，同位素标记化合物从此作为放射性同位素应用的一个新门类在国内开始发展。八十至九十年代，中科院上海药物研究所、天津医药科学研究所、军事医学科学院、中国农业科学院原子能利用研究所等单位相继开展过相关的研究[15]。九十年代以后，由于多种原因，国内氚、碳-14等标记化合物研究纷纷终止或陷入停滞。

2010年以来随着国家新药创新研究对同位素标记化合物需求的增长，国内有关单位逐步恢复开展3H标记化合物的制备研究。中国原子能科学研究院与军事医学科学院合作建立同位素标记联合实验室，恢复开展3H及14C标记化合物的合成技术研究，已先后合成非定位和定位3H标记化合物数十种，设计并合成了盐酸二氢埃托啡、盐酸苯环壬酯、盐酸戊乙奎醚等创新药物的3H标记化合物。合成了14C标记的氰基丙烯酸正丁酯和14C标记羧甲基纤维素等化合物。目前国内具备3H和14C标记化合物研制能力的还有中科院上海应用物理研究所。此外国内一些公司也开展了14C标记产品的合成工作，如无锡贝塔医药科技有限公司建立了多种14C和13C前体化合物制备工艺，合成了14C标记的尿素等多种药物小分子。

3 3H与14C标记化合物的应用

3.1 在新药和医疗器械研发领域的应用

3H与14C标记化合物在新药研究中主要作为示踪剂来研究药物在生物体中吸收、分布、代谢、排泄规律，考察药物在体内的物质平衡及排除途径，获得组织分布数据，确定药物在体内的清除机制，确定血液和排泄物中的代谢产物谱，研究药物在体内的生物利用度等。14C标记化合物是国际上药代动力学研究中经常采用的示踪剂，国家药品监督管理局药品审评中心在2014年《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》中正式将放射性同位素标记研究方法列入临床前药物代谢研究的指导原则。14C因其核素特性成为小分子药物示踪剂的首选，目前应用于药代动力学研究中的放射性标记化合物中14C标记占比超过80%。3H的特性与14C接近，与之相比合成成本更为低廉，但由于3H标记化合物在体内降解过程中会形成3HO2，影响对药物代谢性质的分析，从而限制了其应用。

近年来，3H与14C标记化合物也越来越多应用于可降解医疗器械的研发过程，对全面阐明可降解医疗器械植入体内后代谢和处置过程提供帮助，为医疗器械产品注册和临床安全应用打下基础。

3.2 在农业领域的应用

3H与14C标记化合物对农药学的发展起到了巨大的推动作用，3H与14C标记的农药对于研究其在环境中的残留、迁移和降解途径，农药在动植物体内的吸收、传导、分布、代谢情况，农药的作用机理等都发挥了重要作用，为制定农药安全使用标准、科学合理使用农药、控制农药残留及开发低毒、高效的农药新品种等提供科学依据。我国的放射性同位素标记农药的合成与示踪研究始于上世纪60年代。浙江大学率先开展了农药标记合成研究，先后利用14C、32P、35S、76As等多种放射性核素，研制了包括有机磷、有机氯、有机氮、有机砷的多种标记农药，开拓了应用同位素示踪技术研究农药对环境污染及其防治的新领域[16]。中国农业科学院原子能利用研究所合成了主要包括有机磷、有机硫、有机氯、有机砷和有机汞等数十类放射性同位素标记农药，利用同位素示踪动力学理论和方法对六六六、乙酰甲胺磷、杀螟腈等多种标记农药在农业生态系统中的环境行为与归趋作了系统研究，为我国科学安全使用农药做出了重要的贡献。目前碳-14标记化合物仍在农药开发中发挥着重要促进作用[17]。

3.3 在工业领域的应用

放射性标记化合物在工业上的一个重要应用是用于油田的示踪[2]，如3H标记化合物等。示踪剂监测技术通过向油田注入井中注入能够与已注入的流体相溶的放射性示踪剂,从而跟踪已注入流体在油层中的运动轨迹,及其穿越油层后在生产井上检测示踪剂的产出浓度的变化,获取示踪剂响应曲线,从而分析油层信息和开采动态的方法。同位素示踪剂是用于描述有关井间油层非均质性和流动性的重要手段,对评价剩余油分布,进而在整体上认识油水运动规律,以及对于油田二次采油和三次采油计划的实施,都具有重要的现实意义。与传统的化学示踪相比，同位素示踪技术具有明显的技术先进性，其具有种类多，检测灵敏度高，稳定性和通用性好，与地层流体配伍性好等优点。

3.4 在临床上的应用

14C在医药领域的一个重要应用是用于14CO2呼气检测试剂，被检者接受一定量14C标记的药物，该药物在被检者体内的某一部位代谢后，产生14C标记的CO2气体并呼出体外，通过检测其含量等参数，来研究机体的代谢情况或反映器官的代谢功能。目前临床上使用最广泛的CO2呼气试验为14C-尿素呼气试验检测胃幽门螺杆菌(Hp)，这是一种简单、快速、灵敏、无创伤性的检测方法，具有准确率高、无痛、无创、快速简便、无交叉感染的优点。除已用于胃幽门螺杆菌感染诊断的14C-尿素外，用于肝脏功能诊断、胰腺疾病诊断、胃排空检测、小肠细菌过度生长检测、肠道吸收功能等检测的14C标记药物也在进行研究开发[18]。

4 展望

3H及14C标记化合物几乎囊括了所有有机化合物的种类及含氢、碳的无机物。国际上以商品形式出售的14C标记化合物包括了氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核酸类、类脂类、类固醇类及医学研究用的神经药物、受体、维生素和其他药物等，目前市场上能提供的3H或14C标记化合物品种已达1 300多种。约占所有放射性标记化合物的一半。作为商品开发的主要产品包括氨基酸及其衍生物、单糖类碳水化合物、化学中间体和试剂、放射性同位素标记的配体和临床用制剂。

目前国内从事放射性标记化合物制备的单位比较少，其研制技术水平、产品品种、产业规模等与国际相比还有差距，大部分标记化合物还都依赖于国外进口。目前国际14C标记市场约占放射性同位素标记市场份额的一半以上，规模约7～10亿美元，随着生命科学和新药研发需求的不断扩大，各国政策法规中将放射性同位素标记作为重要的标准，市场空间有进一步扩大的趋势。2019年国内放射性同位素标记化合物的市场大约在1 500～2 000万元，还有很大的市场空间。近年来，国内除了科研院所外，已经有部分企业通过解决原料问题而在逐步介入这一领域。总体来看，目前放射性同位素标记的服务以综合一体化为主。一是放射性同位素标记的定向委托和通用试剂的综合一体化，国外的大型仪器设备提供商均是采取的这种模式；二是将放射性同位素标记与药物代谢联合的一体化服务。定向委托的一对一服务，属于被动服务模式，依靠科研院所的资源优势和影响承接委托的新药合成、化合物标记等的服务。通用单体、原料和检测试剂盒则是主动的服务。以两者结合的方式更适合当前流行的模式。生命科学领域研究用的氨基酸、碱基、单糖等的标记有比较好的发展前景，可以考虑介入。随着放射性同位素标记在新药研究开发中应用的日益广泛，通用型的研究工具，例如同位素标记的配体、受体、转运体等的需求会不断增加。

随着质谱技术的发展，对稳定同位素的检测灵敏度也在进一步提高，稳定同位素标记化合物在新药开发、生命科学研究等领域的需求将进一步增加。作为示踪剂的放射性标记化合物检测灵敏度高的优势在逐渐缩小，在3H及14C等放射性标记化合物的研究开发时必须面对稳定同位素竞争的局面，如何发挥放射性同位素的优势，克服操作不便的缺点也是放射性标记化合物在未来发展时需要考虑的重要因素。