重症监护室患者及物表中分离的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌分子流行病学与耐药机制分析

陈 涛 唐 娇 杜晶晶 刘小花 陈 静

成都市新都区人民医院检验科，四川成都 610500

由于碳青霉烯类抗菌药物的大量使用，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）也开始出现，并在全球范围内迅速播散，成为公共卫生所面临的重大威胁[1]。CRKP 除对以亚胺培南、美罗培南为代表的碳青霉烯类抗菌药物耐药外，对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物也具有高度耐药性，呈现多重耐药的现象[2]。成都市新都区人民医院（以下简称“我院”）微生物实验室数据显示，2019 年7 月至2020 年6 月从我院分离到的CRKP 菌株99%均来自于医院重症监护室（intensive care unit，ICU）。医院感染管理科、临床微生物室立即对我院ICU 环境物表进行了大量的采样检测，结果在ICU 一个听诊器表面分离到1 株CRKP菌株。本研究对我院ICU 病房患者及物表中收集的29 株CRKP 的耐药性与耐药机制及同源性进行分析，为临床合理用药和医院感染控制提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集我院2019 年7 月至2020 年6 月ICU 病房患者及物表中分离的CRKP 非重复菌株29 株（患者28 株，物表1 株），作为研究对象。

1.1.2 仪器与试剂 贝克曼MicroScan WalkAway40 全自动细菌鉴定药敏分析仪、上海力申Heal Force HPsafe1200LC 生物安全柜、上海力申HF160W CO2培养箱、BIO-RAD Molecular 凝胶成像系统、ABI 3500dx 基因分析仪、Millipore 纯水仪、Oxoid 药敏试验纸片；成都瑞琦哥伦比亚血平板；郑州安图MH 琼脂平板等。

1.2 研究方法

1.2.1 CRKP 菌株鉴定及药敏试验 采用MicroScan WalkAway40 全自动细菌鉴定药敏分析仪对细菌进行鉴定及药敏检测，同时K-B 法进行补充药敏试验。药敏试验结果严格参照美国临床和实验室标准化协会M100-S27 标准[3]进行判读，替加环素敏感性参照美国食品药品管理局标准[4]进行判读，头孢哌酮舒巴坦敏感性参照美国临床和实验室标准化协会M100-S23头孢哌酮标准[5]进行判读。其中敏感率=（药敏结果敏感菌株数/总株数）×100%；中介率=（药敏结果中介的菌株数/总株数）×100%。质控菌株ATCC700603，购自国家卫生健康委临床检验中心。

1.2.2 碳青霉烯耐药基因检测 煮沸法提取细菌DNA，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增5 种常见碳青霉烯酶基因，包括A 类（blaKPC）、B 类（blaNDM、blaVIM、blaIMP）和D 类（blaOXA）[6-8]。引物序列及反应条件见表1。引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。取扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，将扩增阳性产物进行一代测序，结果与美国国立生物技术信息中心数据库进行比对，得到CRKP 菌株的耐药基因类型[9-10]。

表1 碳青霉烯酶基因引物序列及反应条件

1.2.3 多位点序列分型（multilocussequencetyping，MLST）提取CRKP 的DNA，参照MLST 网站（http//bigsdb.web.pasteur.fr/kleb-siella/primers-used.html）上公布的肺炎克雷伯菌7 对管家基因序列合成引物，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。扩增7 对管家基因的引物序列及反应条件见表2。PCR 产物送四川金域医学检验中心有限公司测序，将测序结果与MLST 数据库比对，获得CRKP 菌株的ST 型别。

表2 肺炎克雷伯菌管家基因引物序列及反应条件

1.2.4 脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）同源性分析 参照美国疾病控制与预防中心PulseNet 提供的PFGE 相关标准化操作程序[11]，对检出的MLST 型最多的CRKP 菌株进行PFGE 同源性分析，PFGE 条件参照文献方法操作[11]。根据电泳结果显示的条带数进行细菌同源性分组。相同大小且条带数都相同为一组，不同条带数为另一组。

1.3 数据分析

药敏结果用WHONET 5.6 软件进行数据分析，计数资料采用例数或百分率表示。

2 结果

2.1 抗菌药物敏感试验结果

29 株CRKP 菌株耐药特征表现为对替加环素及多黏菌素B 均敏感，对阿米卡星、庆大霉素的敏感率较高，对其他抗菌药物均呈现出较高的耐药率。见表3。

表3 29 株CRKP 对常用抗菌药物敏感性结果分析[株（%）]

2.2 碳青霉烯酶基因型检测结果

PCR 产物测序显示28 株CRKP 携带NDM-1，1 株携带KPC-2，未检出其他类型碳青霉烯酶基因。见表4。

2.3 MLST 分型结果

29 株CRKP 菌株一共检出6 种MLST 型，其中ST12 型占75.9%（22/29，患者21 株，物表1 株）。ST23型和ST2736 型均占6.9%（2/29），ST1031 型、ST2882型均占3.4%（1/29）。此外，1 株菌MLST 为新ST 型，目前分型数据库中未收录。见表4。

表4 耐药基因型与等位基因型及MLST 结果

2.4 PFGE 分型结果

将22 株ST12 型菌株进行PFGE 分型，根据扩增条带的数目和大小对菌株之间的同源性进行聚类分析，得到6 种型别，A 型11 株，B 型6 株，C 型2 株，D、E、F型各1 株，见图1。A、B 型均有多株菌存在，且物表分离株为A 型，提示ST12/A 在我院ICU 病区有院内流行趋势。

图1 22 株产NDM-1 型碳青霉烯酶ST12/A 型CRKP 菌株聚类分析

3 讨论

CRKP 感染主要与肺炎克雷伯菌定植或感染病史、肠外营养，使用第三代头孢菌素或碳青霉烯类抗生素有关[12]。由于ICU 病区主要接收危急重症患者，多数患者涉及转院、转科、侵入性治疗、手术治疗等，该病区成为院内感染的高发区域，也是CRKP 主要流行的区域[13-15]。本研究中的29 株CRKP 同时对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等其他β-内酰胺类抗菌药物高度耐药，而对替加环素、多黏菌素B 均敏感，其耐药特点与王健等[16]报道的一致。与河南省临床分离CRKP 耐药情况一致[17]。

不同地区CRKP 的流行基因型不尽相同[18-19]，目前国内报道多以检出KPC-2 型酶的ST11 型为主，金属酶相对较少[20]。刘婷婷等[21]、张志军等[22]、张晓慧等[23]、Kong 等[24]报道及2017 年上海报道[25]的流行型别均以产KPC-2 的ST11 型CRKP 为 主；Chen 等[26]对 重庆西南医院调查发现CRKP 主要携带blaIMP-4为主。而本研究显示我院ICU 病房CRKP 以产NDM-1 型碳青霉烯酶的ST12 型为主要流行型别，未检出ST11 型，与国内报道的流行型别完全不一致。NDM-1 酶属于B 类金属酶，能够水解除氨曲南外的所有β 内酰胺类抗菌药物，包括碳青霉烯类药物[27]，被称为“超级细菌”[28]。B 类金属碳青霉烯酶对碳青霉烯类药物的活性更高，同时对其他抗菌药物耐药性更高。我院CRKP以产NDM-1 型金属酶为主要耐药机制。CRKP 可在医疗环境中广泛存在，可定植于医务人员手部、患者周围环境物体表面及医疗器材等[29]。我院ICU 的听诊器表面检出1 株NDM-1 的ST12/A 型CRKP 菌株，与我院主要流行型别相同，同源性程度较高。医院感染管理科及ICU 病区应引起高度重视，加强对该病区的多重耐药菌的管控措施，加强手卫生管理，常规环境的清洁，有效降低物体表面多重耐药菌的检出率[30]。

综上所述，该院ICU 病区CRKP 耐药率高，主要耐药机制是产NDM-1 型碳青霉烯酶，物表分离株与该病区主要流行菌株ST12/A 型别一致，同源性程度较高，可在院内患者和环境中克隆性传播。因此，及时监测患者和物表的耐药菌，避免耐药菌大范围暴发流行意义重大。医院感染管理科与临床相关科室应采取一系列防控措施，如管理决策、教育性干预、手卫生、合理用药、耐药菌监测、接触隔离、去除定植菌等措施来降低CRKP 的医院感染率、定植率，并对医院感染防控对策提供支持，避免耐药菌株在医院内传播。