甘草酸对脓毒症急性肾损伤大鼠的保护作用及可能机制

周海银 隆彩霞 罗 兰 陈艳瑛 刘萍萍 肖政辉 张树菊

1.湖南省儿童医院急救中心，湖南长沙 410007；2.湖南省儿童医院检验科，湖南长沙 410007

脓毒症是一种由感染引起的全身炎症反应综合征，进一步发展可导致感染性休克，多器官功能障碍综合征，是临床危重患者最主要死亡原因之一[1-4]；甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是甘草的活性成分之一，具有增强机体免疫功能和抑制多种癌细胞增殖的作用[5-9]。然而，GA 对脓毒症致肾损伤的影响及其相关的分子机制尚未报道。因此本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）和脓毒症大鼠，观察外源性GA 对脓毒症大鼠肾损伤的改善作用，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

GA（美国Sigma 公司，批号：50531）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）酶联免疫吸附试验试剂盒（碧云天生物技术公司，批号：PT520、AF7437、AF0195、PV951）；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3，Cl-Caspase-3）、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）及p-ERK、ERK 多克隆抗体（美国Santa Cruz 公司，批号：SC-7271、SC-376861、SC-8418、SC-65496、SC-166943、SC-7480、SC-136960、SC-7383）；Hoechst33342（美国Sigma 公司，批号：B2261）。

1.2 实验动物

成年健康雄性SD 大鼠30 只，体重（200±20）g，购于南华大学实验动物中心，动物合格证号为SCXK（湘）2018-0002。将大鼠置于笼中适应性饲养1 周后用于实验，动物实验符合南华大学动物伦理委员会3R 标准。

1.3 动物分组与模型建立

SD 大鼠分为假手术组、GA 50 mg/kg 组、脓毒症组、脓毒症+GA 25 mg/kg 组、脓毒症+GA 50 mg/kg 组，每组6 只。脓毒症组大鼠腹腔注射LPS（5 mg/kg）[7]；GA 50 mg/kg 组大鼠腹腔注射GA 50 mg/kg；脓毒症+GA 25 mg/kg 和脓毒症+GA 50 mg/kg 组大鼠在LPS注射前1 h 腹腔注射GA 25 mg/kg 和50 mg/kg，假手术组和脓毒症组腹腔注射10%等容二甲基亚砜。注射LPS 后24 h，处死动物，采集肾组织进行后续实验。

1.4 细胞培养与分组

HBZY-1 细胞购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，置于37℃、5%CO2培养箱中，DMEM 培养基培养，DMEM 中添加10%胎牛血清、100 μg/ml 链霉素和100 U/ml 青霉素。

将HBZY-1 细胞分为5 组，分别为对照组、100μmol/L GA 组（用含100 μmol/L GA 的培养基培养24 h）、LPS 组（用含10 μg/ml LPS 的培养基培养24 h 构建肾炎模型）、LPS+GA 50 μmol/L 组和LPS+GA 100 μmol/L组[将HBZY-1 细胞用含10 μg/ml LPS 的培养基培养24 h 后，分别用GA（50 μmol/L 和100 μmol/L）处理细胞1 h]。

1.5 HE 染色观察各组大鼠肾组织病理学变化

肾组织用预冷生理盐水冲洗，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋5 μm 切片，所有切片行HE 染色，在光学显微镜下观察拍摄。

1.6 酶联免疫吸附试验试法测定肾组织中炎症相关因子水平

依据酶联免疫吸附试验试剂盒说明书检测肾组织中TNF-α、MCP-1、ICAM-1 和VCAM-1 的含量。

1.7 Western blot 检测凋亡、炎症及氧化应激相关蛋白表达

采用RIPA 裂解缓冲液裂解，提取总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，采用SDS-PAGE 电泳分离样品，转膜，封闭2 h，加入一抗4℃下孵育过夜，洗涤，然后二抗室温孵育2 h，ECL 显色，曝光、洗片，采用Bio-Rad 成像系统照相。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，两组间比较采用t 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织病理学改变情况

脓毒症大鼠肾间质、肾小球和肾小管有炎症细胞浸润，部分肾小管细胞肿胀和空泡变性等改变，GA 治疗后脓毒症大鼠肾组织上述病理改变明显减轻。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理学改变情况（HE 染色，200×）

2.2 各组大鼠肾组织中TNF-α、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 含量比较

脓毒症组大鼠肾组织TNF-α、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 水平高于假手术组（P ＜0.01）。脓毒症+GA 25 mg/kg 组和脓毒症+GA 50 mg/kg 组大鼠肾组织TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 表达水平低于脓毒症组（P ＜0.05）；脓毒症+GA 50 mg/kg 组大鼠肾组织MCP-1 水平低于脓毒症组（P ＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠肾组织中TNF-α、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 含量比较（n=6）

2.3 GA 对HBZY-1 细胞中炎症相关蛋白表达影响

LPS 组HBZY-1 细胞iNOS、COX-2、NF-κB 蛋白表达水平高于对照组（P ＜0.01）。LPS+GA 50 μmol/L组和LPS+GA 100 μmol/L 组HBZY-1 细胞COX-2、NF-κB 蛋白表达水平低于LPS 组（P ＜0.05 或P ＜0.01）；LPS+GA 100 μmol/L 组iNOS 水平表达低于LPS 组（P ＜0.01）。见图3～4。

图3 各组HBZY-1 细胞中COX-2、iNOS、NF-κB 蛋白表达Western blot 图

图4 各组HBZY-1 细胞中iNOS、COX-2 和NF-κB 蛋白表达水平比较（n=6）

2.4 GA 对HBZY-1 细胞中凋亡相关蛋白影响

LPS 组HBZY-1 细胞Bcl-2/Bax 相对表达低于对照组，Cl-Caspase-3 高于对照组（P ＜0.01）。LPS+GA 100 μmol/L 组HBZY-1 细胞Bcl-2/Bax 相对表达高于LPS 组（P ＜0.01）；LPS+GA 50 μmol/L 组和LPS+GA 100 μmol/L 组HBZY-1 细胞Cl-Caspase-3 蛋白表达低于LPS 组（P ＜0.01）。见图5～6。

图5 各组HBZY-1 细胞Bcl-2、Bax、Cl-Caspase-3蛋白表达Western blot 图

图6 各组HBZY-1 细胞Bcl-2/Bax、Cl-Caspase-3蛋白表达水平比较（n=6）

2.5 GA 对HBZY-1 细胞中氧化应激相关蛋白表达影响

LPS 组HO-1 蛋白表达水平高于对照组（P ＜0.05）。LPS+GA 50 μmol/L 组和LPS+GA 100 μmol/L组HO-1 蛋白表达水平高于LPS 组（P ＜0.01）；LPS+GA 100 μmol/L 组p-ERK 蛋白表达水平高于LPS 组（P ＜0.01）。见图7～8。

图7 各组HBZY-1 细胞中HO-1、p-ERK、ERK 蛋白表达Western blot 图

图8 各组HBZY-1 细胞中HO-1、p-ERK 蛋白表达比较（n=6）

3 讨论

GA 对脓毒症引起的急性肺损伤和急性肾损伤具有保护作用[10-12]。HE 染色观察，脓毒症+GA 组大鼠肾组织中炎症细胞浸润减轻，说明GA 对脓毒症所致肾损伤具有治疗作用。酶联免疫吸附试验法检测发现，经GA 治疗后，脓毒症大鼠肾组织中TNF-α、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 表达下降，说明GA 可能通过抑制NF-κB 信号通路，从而下调炎症及趋化因子表达，起到减轻肾组织中炎症反应的作用。

NF-κB 可调节许多参与早期免疫及炎症反应的分子，包括TNF-α、白细胞介素-2、iNOS、COX-2 等，是目前公认的介导炎症反应的主要信号通路[13-17]。在脓毒症中LPS 促进iNOS 在各种细胞中的表达，导致大量一氧化氮（nitric oxide，NO）释放，最终引起炎症反应和组织损伤[18]。COX-2 属于NO 下游靶点，在正常组织中几乎没有表达，但在NO 刺激下细胞中大量表达[19-20]。经GA 治疗后，HBZY-1 细胞中NF-κB、iNOS、COX-2 蛋白表达水平降低，提示GA 可抑制LPS刺激 的HBZY-1 细 胞NF-κB 信 号 通 路，iNOS 表 达下降，减少NO 释放，进而下调COX-2 表达，减轻炎症反应。

Bcl-2 家族是细胞凋亡的关键调控因子，其中促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2 通过在线粒体外膜上形成不同的孔来调节膜通透性[21]。Bcl-2/Bax 比值可决定Caspase-3 的激活状况和细胞凋亡的严重程度[22]。经GA 治疗后，HBZY-1 细胞中Cl-Caspase-3蛋白表达水平降低，Bcl-2/Bax 比值升高，提示GA 对LPS 诱导的细胞凋亡有较强的保护作用。

HO-1 是一种由刺激诱导的应激蛋白，具有明显的抗氧化活性[23]。ERK 是MAPK 家族中第一个被发现的成员，MAPK 和HO-1 都能被刺激激活，HO-1 的表达受酪氨酸磷酸化的调控，因此MAPK 与HO-1 之间存在一定的关系[24]。经GA 治疗后，HBZY-1 细胞中HO-1、p-ERK 蛋白表达水平升高，提示GA 可通过进一步激活ERK 信号通路，促进HO-1 表达，减轻氧化应激反应，与文献[25]报道基本一致。

综上所述，GA 可抑制NF-κB 信号通路，对LPS诱导的HBZY-1 细胞凋亡、氧化应激和炎症反应具有保护作用。