肺腺癌组织促血管生成素-2表达及其与临床病理学特征和预后的关系*

时 杨，赛文莉，陈金亮，姚 敏，姚登福

（1南通大学第四附属医院胸外科，江苏盐城 224001；2南通大学附属医院临床医学研究中心；3南通大学第二附属医院呼吸内科）

肺癌形成是多基因异常、多阶段发展的复杂过程,临床及基础研究显示癌基因、抑癌基因、微小RNA、缺氧微环境及血管生成相关因子等与肺癌预后明显相关[1-2]。促血管生成素(angiopoietin,Ang)家族包括Ang-1,Ang-2,Ang-3和Ang-4,分别定位于8q22,8q23,20q13和20q13,分别由498,496,523和503个氨基酸组成肽链[3-4]。其中Ang-2含9个外显子、8个内含子,核苷酸开放阅读框架为1 491 bp,分子量为74 KD,受刺激后与内皮细胞表面酪氨酸激酶-2(Tie-2)结合,降低内皮细胞稳定性,刺激新血管生成,促进肿瘤转移[5-6]。肺腺癌约占肺癌35%,是最常见的组织学亚型。仅1/3早期患者可行手术或放射治疗,晚期及55%早期患者可能死于癌症进展或复发,虽可选择化疗和靶向治疗,但5年生存率仅25%左右[7-8]。正常肺组织中Ang-2低表达或无表达,肺癌进展时Ang-2过表达以满足血管重建或渗透,与癌细胞转移等密切相关[9-10]。本文以组织芯片及免疫组织化学方法,研究肺腺癌及其癌旁组织中Ang-2的表达情况及其与临床病理学特征的关系和预后价值。

1 材料与方法

1.1 人肺腺癌组织经医院医学伦理委员会同意,收集2012年1月—2015年12月我院手术切除的60例肺腺癌组织标本,其中高分化41例,中/低分化19例;国际肺癌研究协会TNM分期Ⅰ～Ⅱ期45例,Ⅲ～Ⅳ期15例。纳入标准:(1)病理学诊断均为原发性肺腺癌;(2)术前未接受过任何治疗;(3)临床记录及术后随访资料完整。随访截至2020年12月。

1.2 组织芯片（tissue microarray，TMA）制备取患者术后癌组织及癌旁组织,进行病理学检查,石蜡切片标记,以TMA制作圆柱形,聚赖氨酸玻片孔径1.5 mm,芯间距0.2 mm,于55℃固定10 min,冷却后4℃保存。

1.3 免疫组织化学分析10%中性福尔马林液固定组织,石蜡包埋、切片(4μm)。常规脱蜡,水化,高压加热法修复抗原,3%H2O2阻断过氧化物酶,25℃,30 min,封闭液室温孵育30 min以封闭非特异性抗原。滴加兔抗人Ang-2抗体(ab155106;Abcam,UK),4℃过夜。PBS洗3次,加羊抗兔IgG二抗(A21030;Abbkine,USA),室温30 min,PBS洗3次。加50μL新配DAB显色5 min,水洗5 min。苏木素复染,脱水、透明、封片。在显微镜(Olympus公司,BX50)下观察组织芯片上Ang-2的表达并摄片。

1.4 免疫组织化学分级Ang-2表达强度分4级:深棕色呈粗颗粒状为(+++),计3分;棕黄色有细颗粒状为(++),计2分;浅黄色未见颗粒为(+),计1分;不着色为(-),计0分。记录阳性细胞百分率,采用X-tile软件分析找出最佳分界值计算结果。根据Ang-2表达强度分为低表达组和高表达组,Ang-2不着色(-)或较淡(+)为低表达组,Ang-2呈中等程度(++)或强阳性(+++)为高表达组。

1.5 统计学处理采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析处理,Graphpad Prism 5.0软件绘图。计量资料以±s表示,组间比较采用t检验;以SPSS在线软件进行单／多因素分析;计数资料以频数和率表示,组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier生存曲线分析生存时间。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺腺癌及癌旁组织中Ang-2表达肺腺癌组织中Ang-2染色呈棕褐色或黄色,主要定位于胞浆和胞核,分布均匀(图1A1,A2);癌旁组织中Ang-2染色较淡(图1B1,B2),其强度明显低于腺癌组织。肺腺癌组织Ang-2阴性11例,弱阳性(+)2例,中等阳性(++)17例,强阳性(+++)30例,阳性率81.7%,高表达率78.3%;癌旁组织中Ang-2阴性(-)51例,弱阳性(+)6例,中等阳性(++)3例,强阳性(+++)0例,阳性率为15.0%,高表达率5.0%;肺腺癌组织Ang-2阳性率和高表达率高于癌旁组织,差异均有统计学意义(P＜0.05),提示Ang-2过表达可能在肺腺癌发生发展中发挥重要作用。

图1 肺腺癌组织与癌旁组织中Ang-2表达

2.2 肺腺癌Ang-2表达与临床病理特征关系肺腺癌组织Ang-2阳性表达与肿瘤大小、TNM分期及患者5年生存率相关,均具有统计学意义(P＜0.05)。Ang-2阳性表达与性别、年龄、分化程度及有无淋巴结转移无关(P＞0.05)。见表1。

表1 肺腺癌组织Ang-2阳性表达与临床病理特征的关系 例（%）

2.3 影响肺腺癌患者预后的单因素及多因素回归分析单因素分析显示,肺腺癌组织中Ang-2表达、分化程度、TNM分期与患者5年生存率显著相关;多因素分析显示Ang-2水平是肺腺癌患者预后的独立危险因素,Ang-2高表达肺腺癌患者5年生存率降低。见表2。

表2 影响肺腺癌患者5年生存率的单因素和多因素分析

2.4 肺腺癌患者Kaplan-Meier生存曲线分析Kaplan-Meier生存曲线分析显示,Ang-2高表达组的5年总生存率明显低于低表达组,差异有统计学意义(χ2=11.357,P＜0.001)。见图2。

图2 肺腺癌患者Kaplan–Meier生存曲线

3 讨 论

肺癌是全球癌症死亡的首要原因,尽管近年低剂量CT技术在早期诊断中广泛应用,然而仍有大部分患者诊断时已是晚期或伴转移。虽有多种靶向药物能延长患者生存时间,但不能降低死亡率[1-2]。肺癌因癌细胞转移和耐药等原因疗效欠佳,寻找新的分子靶点和改进疗效倍受重视。肺癌发展涉及原癌基因激活、抑癌基因失活及凋亡相关基因异常,瘤体增大引起缺氧从而促进Ang-2表达,促进新血管生成[11-12]。Ang-2定位于8q23,由496个氨基酸组成,肽链N端信号肽由含20个疏水氨基酸组成,约200个氨基酸卷曲成螺旋结构域,折叠弯曲形成四级结构[3]。Ang-2通过竞争性结合内皮细胞表面Tie-2,拮抗血管紧张素-1,降低内皮细胞稳定性,并刺激血管及淋巴管增殖,形成新血管促进肺癌生长及转移。在肺癌组织缺氧微环境中Ang-2异常表达,促进血管内皮细胞迁移、增殖和新生血管生成[13]。Ang-2参与血管新生的启动、调节和延续过程。抗VEGF单抗或抗VEGF受体药物联合化疗可有效靶向新生血管,延长患者生存期,但因相关分子信号通路较多以及不同肿瘤的异质性可造成抗血管疗效差[14]。因肿瘤血管结构不稳定和间质流体压力增加,使得肿瘤血管灌注差,导致组织极度缺氧和药物输送不足,反而促进肿瘤进展,侵袭、远处转移和化疗耐药[13,15]。

本研究结果显示,肺腺癌组织Ang-2阳性率和高表达率高于癌旁组织,Ang-2表达、肿瘤分化程度、TNM分期与患者5年生存率相关,Ang-2水平是肺腺癌患者预后的独立危险因素,Ang-2高表达患者5年生存率降低,提示Ang-2表达可能在肺腺癌发生发展中发挥重要作用,并与患者临床特征有关,有助于判定预后。

文献报道,血清Ang-2为非侵入性标志物,检测方便,可用于诊断或联合诊断外,也可能用于术后疗效监测[16]。靶向活化Tie-2,抑制Ang-2表达,或双重抑制VEGF受体/Ang-2可减少肿瘤血管生成,弥补抗VEGF受体疗法的局限,将给肺癌诊治带来新希望。