HPLC-MS/MS快速检测果蔬中多种农药残留的研究

冯超 姜雅红

（昌邑市检验检测中心，山东 昌邑 261300）

一、概述

天然阿维菌素由8 个组构成，包含总含量≥80%的A1a、A2a、B1a 和B2a 及总含量≤20%的A1b、A2b、B1b 和B2b。就当前生物农药市场而言，阿维菌素有着极高的欢迎度和竞争性。目前初级农产品的农药残留物中，针对阿维菌素残留检测一直只有独立的检测方法，提取方法复杂检测效率低且不能同时与其他农残共同检测。

二、课题内容

本课题目标是建立一种新的超高效液相串联质谱分析方法同时检测残留在水果、蔬菜组织中阿维菌素与氨基甲酸酯类、有机磷类等22 种农药残留量，实验首先从样品前处理入手，考察了不同提取液对实验结果的影响；其次，分析了固相萃取的最优化方法；最后，从检测模式、目标定量/定性离子选择、流动相的种类和配比三个方向对实验条件进行探索和优化。通过测定，进行定量分析，从而找到最佳的实验方法，提高检测效率。

为实现上述目的本发明提供一种新的超高效液相串联质谱分析方法包括：

A 样品预处理中目标物提取过程优化得到最佳提取方案；

B 对比不同类型固相萃取柱对干扰物的净化水平，获取最佳净化柱型；

C 电化学离子源正负模式下对目标物离子化效率，得到最佳响应模式；

D 目标物母离子加H+电荷与加Na+电荷在不同流动相中的响应，获得最佳定量离子与定性离子及相应流动相配比。

三、国内外研究现状

由于阿维菌素的毒性较强和世界各国逐步对其的禁用，其在水果蔬菜中的残留检测分析研究成为行业热点。因此发展只需一种方法便可同时检测在同一基质中的阿维菌素及氨基甲酸酯类、有机磷类农药则非常必要。目前，阿维菌素残留检测方法主要是仅针对其单一化合物的液相色谱-质谱法和液相色谱法。

四、研究主要内容和结果

（一）原理

样品加正己烷饱和乙腈溶液均质提取后加氯化钠离心脱水，提取液过固相萃取柱进行净化后收集流出液氮吹近干后定容，高效液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量。

（二）试剂和仪器

除另作说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为一级水。

1.试剂。甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷均为色谱纯（Fisher 试剂），氯化钠（国药），NH2-Carb 固相萃取柱、NH2 固相萃取柱、弗洛里硅胶固相萃取柱（迪马科技）。阿维菌素、氧化乐果、多菌灵、涕灭威、内吸磷、涕灭威砜、涕灭威亚砜、哒螨灵等各100μL 于10mL 容量瓶中，甲醇定容至10mL，浓度1μg/mL。

2.仪器。液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪（HPLC-MS/MS），配ESI 源（赛默飞世尔科技公司，TSQ-UltraEMR）；冷冻离心机；固相萃取装置（安捷伦科技公司）；全自动均质器（厦门睿科）；电子天平；旋涡混合器（IKA）；氮吹仪。

（三）分析步骤

1.提取。使用50mL 具塞离心管称取20g 样品，加入7g 氯化钠（分析纯），加入20mL 正己烷饱和乙腈（色谱纯）溶液，漩涡混合30S，使用均质器8000-10000r/min 均质5min。完成后转移至低温离心机6000r/min 离心5min。离心完成后，取乙腈上清液10mL，氮吹（40℃）近干，残余物用3mL2%二氯甲烷的甲醇溶液复溶。

2.净化。将NH2固相萃取柱（500mg/6mL）用5mL甲醇活化，加入复溶液，收集所有流出液氮吹（40℃）近干，用甲醇水（50+50）1mL 定溶，过0.22μm有机滤膜上机测定。

3.测定。液相色谱-质谱/质谱参考条件：

a.色谱柱：C18 超细柱，100 mm×1.9 mm（内径），粒度<5μm。

b.流动相：甲醇+2mmol/L 乙酸铵的甲酸水溶液（0.2%）=10+90。10min，配比互换梯度洗脱。

c.流速：0.30 mL/min。

d.柱温：40℃。

e.进样量：5μL。

f.离子源：电化学离子源（ESI 源），正离子监测模式。

计算样品中阿维菌素及各类目标物残留量：

X=cv/1000m

X-试样中各种农残目标物残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）

c-标准工作液中各种农残目标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）

v—试样的提取液体积，单位为毫升（ml）。

m—最终试样提取液代表的试样称重量，单位为克（g）。

五、结果与讨论

（一）提取剂尝试了丙酮、甲醇、乙腈、二氯甲烷，由于各类目标物在不同溶剂中的溶解度不同，为最大效率的提高提取效率，对比了多种提取剂及混合提取剂：丙酮挥发性强，在均质过程中不能与样品充分接触；二氯甲烷有较强毒性；甲醇能够样品中的水互溶，缺少有效分离方法；乙腈能够充分溶解阿维菌素及各类目标物，且与饱和氯化钠溶液互相不容，毒性相对较轻。综合了各方面的条件，最终确定正己烷饱和乙腈作为提取溶剂。

（二）固相萃取柱及洗脱溶液比对，通过尝试NH2 柱、PSA 柱、弗洛里硅胶柱、NH2-Carb 复合柱和不同种类的洗脱液配比。弗洛里柱仅对有机氯类农残干扰物保留效果明显，对色素有机酸保留能力一般。PSA 柱对多种干扰物有较强保留，但价格相对昂贵，性价比不高。NH2柱对有机酸、色素、脂肪酸等目标干扰物有较好的保留能力，且对目标物农残保留能力较弱，性价比高，但对绿叶菜、火龙果等叶绿素、花青素色素含量较高样品净化能力不足，此时应使用NH2-Carb 复合柱进行样品净化。洗脱溶液尝试了甲醇，乙腈，以及二氯甲烷甲醇混合液，乙腈洗脱能力过强，干扰物无法保留在柱子上，降低了净化效果；纯甲醇需用较大体积洗脱，才能有效将目标物淋洗下来；我们试着在甲醇溶液中添加1%-5%的二氯甲烷，通过比对发现二氯甲烷配比在2%时，只需3-4mL 洗脱液便可有效将残余目标物从氨基柱上洗脱下来。最终优化后的净化条件为：氨基净化柱，2%二氯甲烷的甲醇洗脱液。

（三）质谱条件优化

GB 23200.20-2016 中，检测阿维菌素残留物的质谱条件为电化学离子源（APCI 源），负离子模式。APCI 源能够将非极性化合物较好的离子化，且负离子模式相较正离子模式状态下的检测器对目标化合物的响应相对偏低，但也相对正离子模式引入的干扰噪音减少更大。但考虑到兼顾有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类多种农残的检测，选择了更容易电离多种化合物的电化学离子源（ESI 源），正离子模式，并通过调整目标物离子对，使得质谱仪对阿维菌素及各类农残有较好的响应。阿维菌素在ESI 源电离下存在加H+离子碎片和加Na+离子碎片；但我们在流动相中引入了乙酸铵，因此可以获得响应较好的加NH3+离子碎片，既保证了对干扰物的有效去除，同时兼顾了仪器响应大小，以此作为定量离子。

（四）液相色谱分离条件优化，现有国标方法用乙腈+水作为流动相，但乙腈在C 18 超细柱上的洗脱能力过强，各类目标物在液相色谱柱上的保留时间相对过于集中容易使目标物与杂质共同进入质谱，影响质谱仪对目标物的响应，且乙腈毒性较强。甲醇毒性相对乙腈更低，其略低于乙腈对目标物的洗脱能力，能够有效实现目标物与基质中杂质干扰的有效分离，且有效保证各目标物保留时间相对合理分布。

（五）最低检出限

以3 倍信噪比计算，确定本方法对阿维菌素及各类农残的最低检出限为2.0μg/kg。使用本方案可在尽短时间内有效同时检测在同一基质中的阿维菌素及有机磷、氨基甲酸酯类农药。

（六）准确性考察（加标回收率测定）

分别以阴性果蔬样品作为基质进行加标回收定量实验，称取样品20g，且做平行实验。分别在样品中混入2.0μg/kg 和20.0μg/kg 两种级别浓度的标准混合溶液，充分混匀，按照本方法的操作步骤进行测试。上机测试结果：

1.样品添加水平在2.0μg/kg 时，各组分检出值：阿维菌素1.92、氧化乐果2.10、多菌灵1.94、涕灭威2.03、噻虫嗪1.96、涕灭威砜1.95、涕灭威亚砜1.93、吡虫啉1.94、克百威1.92、3-羟基克百威2.04、啶虫脒2.06、灭多威1.94、敌百虫1.96、内吸磷1.94、速灭威1.98、甲萘威2.07、异丙威2.04、仲丁威2.10、嘧霉胺2.10、甲氨基阿维菌素2.07、哒螨灵2.10（μg/kg）；所有农药残留目标物的回收率均在96.2%-105.2%之间。

2.样品添加水平在20.0μg/kg 时，各组分检出值：阿维菌素19.5、氧化乐果20.7、多菌灵20.4、涕灭威18.6、噻虫嗪20.5、涕灭威砜18.5、涕灭威亚砜18.8、吡虫啉18.8、克百威18.6、3-羟基克百威19.0、啶虫脒19.8、灭多威18.8、敌百虫20.3、内吸磷19.8、速灭威19.0、甲萘威19.3、异丙威20.6、仲丁威20.8、嘧霉胺21.2、甲氨基阿维菌素20.4、哒螨灵19.5（μg/kg）；所有农药残留目标物的回收率均在92.5%-104.2%之间。

可见测定结果和回收率，测定结果符合农药残留物检测定性定量分析的要求。

（七）精密度考察

实验采用阴性样品进行阿维菌素、有机磷、有机氯、氨基甲酸酯等21 种农药残留物的添加水平为10μg/kg 时，连续六次测定，RSD 分别为阿维菌素1.32%、氧化乐果1.59%、多菌灵1.52%、涕灭威2.31%、噻虫嗪1.81%、涕灭威砜2.5%、涕灭威亚砜2.3%、吡虫啉1.63%、克百威1.23%、3-羟基克百威1.57%、啶虫脒1.59%、灭多威1.61%、敌百虫2.1%、内吸磷2.7%、速灭威2.63%、甲萘威2.64%、异丙威2.12%、仲丁威2%、嘧霉胺2.64%、甲氨基阿维菌素2.58%、哒螨灵2.1%，表明仪器稳定性良好。

六、结论

从样品前处理入手，确定正己烷饱和乙腈溶液作为提取溶剂；其次，分析了固相萃取的净化条件为：氨基净化柱，2%二氯甲烷的甲醇洗脱液。最后，从检测模式、目标定量/定性离子选择、流动相的选择和配比三个方向对实验条件进行探索和优化，确定了ESI 源正离子模式和主要目标物离子对，流动相为甲醇+2mmol/L 乙酸铵的甲酸水溶液（0.2%）配比10+90，配比互换梯度洗脱。结果表明：该方法操作简便、提取效率高、具有高准确性和重复性，适用于水果蔬菜等农产品中同时检测阿维菌素、有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的定性、定量分析测定。