C 群脑膜炎球菌多糖层析纯化工艺条件的优化

苏晓叶，高磊，程亚君，李倩，田雨，刘刚

北京智飞绿竹生物制药有限公司，北京 100176

现行多糖纯化分离技术多采用传统的乙醇沉淀与苯酚抽提工艺［3-6］，该工艺过程伴随复杂的反复超滤离心及透析，时间周期长，且过程引入强毒性苯酚［7-8］，影响产品安全性及产品质量。因此，近年来，采用现代化的生物技术纯化制备细菌荚膜多糖已成为新的趋势［9-15］，关于多糖层析纯化的相关研究多采用Capto Adhere 与Capto DEAE 串联的方法（命名为：流穿模式多糖层析）去除脑膜炎粗多糖样品中的蛋白杂质［16-20］。脑膜炎球菌多糖可流穿式快速通过层析柱，大量蛋白质等杂质则因强电负性而被吸附至层析介质上，最终达到多糖纯化的目的。本文对该技术应用于C 群脑膜炎球菌多糖分离纯化的工艺条件进行了优化，在以往研究的基础上进一步分析缓冲液中SDC 含量、粗多糖浓度以及上样量对层析纯化的影响，以期在保证分离效果的基础上，尽可能增大单次纯化处理量。

1 材料与方法

1. 1 多糖 C 群脑膜炎球菌粗多糖是C 群脑膜炎球菌经十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）处理及乙醇分步沉淀的粗糖，由北京智飞绿竹生物制药有限公司制备并提供。

1. 2 主要试剂及仪器 Tris 试剂及脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate，SDC）购自美国Sigma 公司，均为分析纯；Capto Adhere 和CaptoDEAE 凝胶、AKTApliot 层析系统购自美国GE 公司。

1. 3 多糖样品预处理 取C 群脑膜炎球菌粗多糖溶于100 mL 1. 0% Tris-HCl 溶液（pH 8. 0）中混匀，析出白色固体，过夜反应；1 500 × g 离心10 min 后，经0. 22 μm 一次性滤膜过滤，收集滤液。

1. 4 层析纯化 将XK16／40 Capto Adhere 和XK 16／20 Capto DEAE 柱串联，缓冲液平衡后，将预处理后的多糖样品上样。层析纯化条件：流速为90 cm ／ h，粗多糖浓度为5 g ／ L，洗脱溶液为含0. 5% SDC 的Tris-HCl 溶液，上样量为25% CV（柱体积）。分别以206、280、260 nm 吸收峰监测唾液酸、蛋白、核酸分离情况，收集多糖流穿峰。

1. 5 多糖的脱盐 将收集的纯化样品用50 kD 膜包超滤，进行脱盐处理，冻干后得到多糖粉末。

1. 6 工艺条件的优化

2.1 PITC实施前后总体情况 淮安市2013年推行PITC服务，2012年全市共检测各类人群293 831人次，发现感染者85例，其中通过PITC途径发现34例。2016年共检测601 221人次，发现感染者131例，其中通过PITC途径发现74例。与PITC实施前相比，全市的HIV抗体检测量增长了104.61%，新发现感染者例数增长了54.12%。PITC途径发现的感染者占当年全市新发现感染者的比例由40.00%上升到56.49%。

1. 6. 1 缓冲液SDC 含量 将多糖浓度为2.5 和5.0 g／L的粗多糖分别上样于层析系统，上样量为25% CV，分别用含0. 50%、0. 75%和1. 00% SDC 的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱流速为90 cm ／ h，考察缓冲液中SDC 含量对C 群脑膜炎球菌多糖层析纯化分离效果的影响。分别以206、280、260 nm 吸收峰监测唾液酸、蛋白、核酸分离情况，收集多糖流穿峰。

1. 6. 2 粗多糖浓度 将多糖含量为2.5、5.0 和7.5 g／L的粗多糖溶液分别上样于层析系统，上样量为25%CV，用含0. 50% SDC 的Tris-HCl 缓冲液进行洗脱，洗脱流速为90 cm ／ h，考察粗多糖浓度对C 群脑膜炎球菌多糖层析纯化分离效果的影响。分别以206、280、260 nm 吸收峰监测唾液酸、蛋白、核酸分离情况，收集多糖流穿峰。

1. 6. 3 上样量 将5. 0 g ／ L 粗多糖溶液上样于层析系统，上样量分别为20%、25%和30% CV，用含0. 50% SDC 的Tris-HCl 缓冲液进行洗脱，洗脱流速为90 cm ／ h，考察上样量对C 群脑膜炎球菌多糖层析纯化分离效果的影响。分别以206、280、260 nm吸收峰监测唾液酸、蛋白、核酸分离情况，收集多糖流穿峰。

1. 7 层析柱使用寿命的检测 在最优层析纯化工艺条件下，连续进样5 次，分别收集纯化样品并进行检测，考察层析柱使用寿命。

1. 8 多糖脱盐超滤条件的优化 将收集的纯化样品浓缩至1 L，采用50 kD 膜包，用纯化水进行等体积超滤脱盐，超滤过程中监测SDC 残留量，考察脱盐最佳超滤条件。

1. 9 可比性分析 将上述优化得到的最佳层析纯化条件进行放大化（采用XK50 ／ 50 Capto Adhere 和XK 50 ／ 30 Capto DEAE 串联），同一批次同量粗糖分别用层析纯化和传统苯酚抽提法进行纯化及冻干。分别以206、280、260 nm 吸收峰监测唾液酸、蛋白、核酸分离情况，收集多糖流穿峰。

1. 10 样品检测 实验过程中样品多糖含量用检测唾液酸含量的方法确定，按《中国药典》三部（2015版）通则3102 进行检测；蛋白含量按《中国药典》三部（2015 版）通则0731 第二法lowry 法进行检测；核酸含量按《中国药典》三部（2015 版）通则0401 紫外分光光度法进行检测。

1. 11 统计学分析 采用Excel 电子表格与统计功能进行统计学分析，可比性分析中层析纯化方法和传统苯酚抽提法两者的比较采用t 检验，以P ＜0. 05为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 工艺条件的优化

2. 1. 1 缓冲液SDC 含量对层析效果的影响 当粗多糖浓度为2. 5 或5. 0 g ／ L 时，洗脱溶液中SDC 浓度由1. 00%降至0. 75%、0. 50%时，均可实现多糖与蛋白的分离，见图1。当SDC 含量降至0. 50%时，层析纯化后依然能获得较高的多糖回收率，可实现多糖与蛋白的分离，见表1。

图1 缓冲液中SDC 含量对层析效果影响的层析图谱Fig. 1 Chromatogram of influence of SDC content in buffer on chromatographic effect

表1 缓冲液中不同SDC 含量的层析结果（%）Tab. 1 Effect of SDC content in buffer on chromatography（%）

2. 1. 2 粗多糖浓度对层析效果的影响 多糖浓度为5. 0 和2. 5 g ／ L 时，可实现多糖与蛋白的分离；当多糖浓度升至7. 5 g ／ L 时，多糖吸收峰与蛋白吸收峰重叠，纯化效果差，且试验过程中还发现，该高浓度样品黏度高、杂质较多，在层析柱上会明显出现大量色素沉积，柱压升高，不能高效分离多糖与蛋白。见图2。粗多糖浓度升至5. 0 g ／ L 时，层析法仍能高回收率的分离纯化C 群多糖，见表2。

图2 粗多糖浓度对层析效果影响的层析图谱Fig. 2 Chromatogram of influence of crude polysaccharide concentration on chromatographic effect

表2 粗多糖浓度对层析效果的影响（%）Tab. 2 Effect of crude polysaccharide concentration on chromatography（%）

2. 1. 3 上样量对层析效果的影响 当上样量低于25% CV 时，可将多糖与蛋白较好的分离；当上样量为30%CV 时，多糖吸收峰与蛋白吸收峰出现部分重叠，未能实现多糖的分离纯化。见图3。提高上样量后，蛋白／ 唾液酸比及多糖回收率基本相同，见表3。表明处理量提高至25% CV 仍可实现C 群多糖的分离纯化。

图3 上样量对层析效果影响的层析图谱Fig. 3 Chromatogram of influence of loading volume on chromatographic effect

表3 上样量对层析效果的影响（%）Tab. 3 Effect of loading volume on chromatography（%）

2. 2 层析柱使用寿命 连续5 次进样，多糖蛋白出峰时间、峰型及峰高基本一致，且5 次检测结果数据较稳定，见图4 和表4。表明层析柱连续上样5 次，仍可达到粗多糖分离纯化效果。

图4 连续5 次进样的层析图谱Fig. 4 Chromatogram of five consecutive injections

表4 连续5 次进样后收集样品的检测结果（mg ／ g）Tab. 4 Test results of purified samples after five consecutive injections（mg ／ g）

2. 3 多糖脱盐超滤条件的优化 SDC 浓度标准曲线见图5。当纯化水用量约为20 倍多糖料液体积时，SDC 残留量仅为3. 98 μg ／ mL，达到去除残留SDC杂质的目的，见图6。2. 4 可比性分析 两种方法制备的多糖样品唾液酸、蛋白及核酸含量差异均无统计学意义（P 均＞0. 05），两种样品的质量具有可比性，见表5。表明层析纯化法可在保证多糖样品质量的前提下，提高样品处理速度及处理量。

图5 SDC 浓度标准曲线图Fig. 5 Standard curve of SDC concentration

图6 超滤过程SDC 残余趋势图Fig. 6 SDC residual trend graph during ultrafiltration

表5 两种方法制备的冻干样品检测结果（mg ／ g）Tab. 5 Test results of freeze-dried samples prepared by two methods（mg ／ g）

3 讨 论

层析法纯化分离能力除取决于层析介质的自身性质外，与被分离物的性质及纯化工艺条件也相关，本研究对影响C 群脑膜炎球菌多糖层析纯化的条件（洗脱缓冲液中SDC 含量、粗糖浓度及上样量）进行了优化。

SDC 是一种离子型去污剂，可用于裂解细胞，也可溶解难溶于水的蛋白质。在洗脱缓冲液中加入一定量的SDC，有利于多糖的分离纯化。然而，大量的SDC 引入多糖溶液，不仅需要更长时间的脱盐处理，而且容易造成部分多糖流失。本研究结果显示，洗脱缓冲液中SDC 的含量降低至0. 50%，仍能较好地分离纯化C 群多糖。

粗多糖浓度及上样体积直接体现了层析柱的负荷量，工艺条件优化结果显示，当粗糖浓度提高至5. 0 g ／ L、上样体积最高为25% CV 时，仍可达到分离纯化C 群多糖的目的。当糖浓度和上样体积继续增加时，蛋白质吸收峰与多糖吸收峰出现部分重叠，而无法实现多糖的分离纯化。

流穿模式层析中大部分多糖、蛋白、核酸是流穿下来的，仅有小部分多糖、蛋白、核酸吸附于层析凝胶上，因此并不需要频繁进行高盐除杂蛋白，且减少碱清洁次数可延长层析介质的使用寿命。本研究结果显示，层析柱在连续使用5 次后，多糖、蛋白出峰时间、峰型峰高及纯化样检测结果基本不变，且检测结果符合《中国药典》三部（2015 版）要求。生产过程中可在连续5 次进样后进行1 次高盐清洁及碱液清洁再生。

超滤脱盐条件优化结果显示，仅20 倍多糖料液体积的纯化水就可达到去除糖溶液中SDC 的目的。

综上所述，在层析流速为90 cm ／ h 的条件下，粗多糖上样浓度可提高至5. 0 g ／ L，流动相SDC 浓度可降至0. 50%，上样量升高至25%，层析法可较好地分离纯化C 群脑膜炎球菌多糖；超滤脱盐后SDC 残留量仅为3. 98 μg ／ mL；层析纯化可连续进行5 次，且层析柱的纯化分离效果基本不受影响。