人类白细胞抗原组织配型基因分型国家参考品的协作标定

胡泽斌，孙彬裕，刘湘，兰更欣，孙晶，于婷，黄杰

1. 中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所，北京 100050；2. 北京博奥晶典生物技术有限公司，北京 101111

目前，人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分型技术已广泛应用于多个领域，如造血干细胞捐献者建库、HLA 群体遗传多态性、HLA 生物学功能、实体器官和造血干细胞移植供受者组织相容性配型等［1-3］。HLA 基因配型可直接判别供受者之间的相容性，在DNA 水平上区分同源异源性。对于实体器官及造血干细胞移植，供受者双方的HLA基因型匹配程度显著影响移植受体的长期存活率，匹配程度越高，长期存活率越高，HLA 基因型主要是指HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 5 个位点［4-5］。肾脏、肝脏等实体器官移植对HLA 基因型匹配程度要求低于造血干细胞移植，因此，一般可使用低中分辨率的HLA 基因分型检测试剂；骨髓移植或造血干细胞移植必须采用高分辨的HLA 分型检测，避免发生严重的免疫排斥反应，导致移植失败［6-7］。近年，中华骨髓库正在积极倡导高分入库，即对HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 等5 个基因座位进行4 位高分辨率分型检测，以期从根本上提高HLA 配型效率。

标准物质是具有准确量值的测量标准，其定值是对标准物质特性量值赋值的过程［8］。测定特性值有许多有效技术途径［9］，包括通过一个或多个实验室采用一种或多种方法进行测量。具体选择的方法取决于该标准物质的类型、预期用途、参加实验室的资质、所用方法的质量及评估特性值的试剂能力。中国食品药品检定研究院研制的HLA 组织配型基因分型国家参考品为定性标准物质，本研究采用多家具有良好资质的实验室通过PCR-SSO 法、PCR-SBT 测序法、NGS 测序法进行协作标定的方式对其进行定值，其中PCR-SBT 测序方法是目前世界卫生组织推荐的HLA 分型方法的“金标准”。

1 材料与方法

1. 1 参考品 HLA 组织配型基因分型国家参考品（编号1 ～38）由中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所提供。

1. 2 主要试剂 One Lambda-All Type NGS 11 位点扩增试剂（NGS 测序法）、One Lambda-SeCore A、B、C、DQB1、DRB1 Locus Sequencing Kit（PCR-SBT 测序法）由赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供；HLA-A、B、C、DQB1、DRB1 位点基因高分辨分型试剂盒（PCR-SBT 测序法）由北京博奥晶典生物技术有限公司提供；Lifecodes A、B、C、DQB1、DRB1 typing kit（PCR-SSO 法）由北京博富瑞基因诊断技术有限公司提供；HLA-A、B、C、DQB1、DRB1 核酸分型检测试剂盒（PCR-SBT 法）由德必碁生物科技（厦门）有限公司提供；国际HLA 质控盘IHWG-SP Reference Pannel由中国食品药品检定研究院提供。

1. 3 HLA 组织配型基因分型国家参考品协作标定方法 选择德必碁生物科技（厦门）有限公司、赛默飞世尔科技（中国）有限公司、北京博奥晶典生物技术有限公司、北京博富瑞基因诊断技术有限公司4家实验室进行协作标定。每家实验室分发3 套HLA组织配型基因分型国家参考品，干冰运输，2 ～8 ℃保存在5 d 内进行检测，-20 ℃保存在15 d 内进行检测。各试验均采用各自的HLA 分型检测试剂检测，在各自的检测平台上进行独立数据分析。共检测38 支国家参考品，PCR-SBT 测序法和NGS 测序法对每个样本测定1 次，PCR-SSO 法对每个样本测定3 次。

1. 4 HLA 组织配型基因分型国家参考品协作标定的实验质量控制 将国际组织相容性工作组的HLA 质控盘（IHWG-SP Reference Pannel）干冰运输至北京博奥晶典生物技术有限公司，采用PCR-SBT测序法同步检测HLA 组织配型基因分型国家参考品和IHWG-SP Reference Pannel 的51 个样本，作为实验的质量控制。

2 结 果

2. 1 协作标定实验 4 家协作单位分别检测38 支HLA 组织配型基因分型国家参考品样本，HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 5 个位点均全部检出。北京博奥晶典生物技术有限公司PCR-SBT 测序法分型结果见表1，德必碁生物科技（厦门）有限公司和赛默飞世尔科技（中国）有限公司的PCR-SBT 测序法分型结果、赛默飞世尔科技（中国）有限公司的NGS 测序法分型的前4 位高分辨分型结果均与表1 中的前4 位高分辨分型结果一致；北京博富瑞基因诊断技术有限公司PCR-SSO 法的前2 或4 位中高分辨分型结果与表1 的前2 位或4 位结果一致。最终取HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 的PCR-SBT 测序法前4位高分辨分型结果作为HLA 组织配型基因分型国家参考品的协作标定结果。

表1 北京博奥晶典生物技术有限公司PCR-SBT 测序法的分型结果Tab. 1 Typing result by PCR-SBT sequencing by Beijing CapitalBio Technology Co.，Ltd

2. 2 国际质控盘的检测 北京博奥晶典生物技术有限公司采用PCR-SBT 测序法检测38 支HLA 组织配型基因分型国家参考品，可全部检出，结果同2. 1项；IHWG-SP Reference Pannel 的51 份样本全部检出，且HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 分型结果与IHWG公布结果一致，表明北京博奥晶典生物技术有限公司采用PCR-SBT 测序法对HLA 组织配型基因分型国家参考品协作标定具有良好的准确性和可靠性。

3 讨 论

本研究中协作标定实验室均为HLA 分型检测领域有较大影响力的国内外生产企业，其相应试剂均具有良好的准确性及稳定性，为HLA 组织配型基因分型国家参考品协作标定提供了保障。PCR-SSO法常用于临床肝脏肾脏等器官移植中的HLA 分型，可报告2 或4 位HLA 中高分辨HLA 分型信息。PCR-SBT 测序法是目前世界卫生组织及国际组织相容性工作组（International Histocompatibility Working-Group，IHWG）共同推荐的HLA 分型的“金标准”，可直接测得序列，报告4 或6 位HLA 高分辨分型信息，但仅能检测部分外显子，如Class-Ⅰ，大部分厂家试剂仅是检测外显子2、3、4，部分会单独提供5、6外显子测序，其他部分无法检测，对2、3、4 外显子的多态性的检测也是有限的。NGS 测序法可报告4、6或8 位的HLA 高分辨分型信息，NGS 法不仅能够测全长，还能够较好地区分等位基因，在罕见基因和新基因的检测上具有较大优势［10-13］。因此，在HLA 分型检测方法上，本研究不仅选择了1 家实验室采用PCR-SSO 分型法对38 支国家参考品进行检测，还联合2 家实验室采用金标准PCR-SBT 测序法对38 支国家参考品中临床检测中要求的部分外显子进行直接测序，且联合2 家实验室采用NGS 测序法对38支国家参考品的全部外显子进行测序，研究结果表明，PCR-SSO、PCR-SBT、NGS 3 种方法对38 支国家参考品的分型结果完全相符，进一步保障了国家参考品定值的准确性。

IHWG 发布了一套HLA 序列多态性参考品质控盘（IHWG-SP Reference Pannel），共包含来自不同个体的51 份DNA 样本，是基于不同种族和地域的多样性基因样本，极具代表性，这些样本的基因型已经多种HLA 基因分型方法验证，包括SBT 测序法，常用于国内外免疫遗传学和组织相容性实验室用于HLA 分型检测的质量控制及HLA 分型试剂的测试验证［14-15］。本研究采用该套IHWG 质控盘作为实验检测的质量控制，51 份DNA 样本的分型检测结果与IHWG 公布结果完全一致，表明本研究对HLA 组织配型基因分型国家参考品定值结果的可信度。

本研究对HLA 组织配型基因分型国家参考品定值进行了准确的协作标定，能够满足其作为标准物质的要求，可用于HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 分型检测试剂盒的准确性评价，适用于荧光PCR 法、PCR熔解曲线法、PCR-SSP 法、PCR-SSO 法、PCR-SBT 和NGS 测序法。采用本参考品进行准确性检测时，其分型结果在制造商标示的分辨率水平上应与参考品已知基因分型结果相符。