绝经后女性LRP5与LRP6基因位点的多态性及交互作用与骨量的异常关系

邵 晗，李思源，高 群，李 军

0 引 言

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种以骨组织微结构受损，骨密度下降为特征的代谢性疾病[1]。目前在中国老龄人口中，约有830万OP患者，绝经后女性约占其中的1/3[2]。目前研究发现，影响OP的危险因素包括雌激素、血糖及血脂水平等[3]；其中有阳性家族史的家庭是临床患者骨量异常(abnormal bone mass，ABM)的另一个危险因素[4]。作为OP的前期阶段，及时给予ABM的患者治疗可延缓OP的发生。由于OP具有很强遗传性，与之相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)已成为研究热点。低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein 5，LRP5)、低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein 6，LRP6)作为Wnt信号通路的经典调节因子，Wnt蛋白与Frizzled受体以及LRP5/6辅受体结合，调节下游分子的转录，影响成骨细胞，诱导骨重建[5]。既往研究多对单个基因单个位点的多态性或突变与OP的关系进行研究，发现LRP5/6基因位点不同程度上参与了ABM的发生；而关于以上2种基因的交互作用、环境因素与ABM发生的相关性研究鲜有报道。基因-基因、基因-环境交互作用，在一定程度上阐明了为何携带易感基因的人群中，仅有部分人群患病；暴露于相同的环境下，也仅有部分人患病。本团队前期的研究已发现LRP5基因位点的多态性与绝经后2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)女性患者BMD的降低有关[6]。为进一步探究多种因素的交互作用，本研究拟测定新疆绝经后女性LRP5基因rs41494349、rs2306862位点和LRP6基因rs10743980、rs2302685位点的交互作用与ABM的关系，以期为预防OP的发生提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象纳入2018年12月-2019年12月石河子大学医学院第一附属医院收治的272例绝经后女性患者。OP按照1994年WHO推荐的诊断标准[7]。依据BMD测结果将研究对象分为对照组(骨量正常组)、ABM组(骨量异常组=骨量减少+OP)。纳入标准：①自然绝经后1年以上女性；②年龄47～80岁；③所有参与者均为汉族，在基因上无任何血缘关系，病史完整。排除标准：1型糖尿病、自身免疫性疾病、甲状腺及甲状旁腺疾病、严重的心、肝、肾疾病及恶性肿瘤对Ca及其他骨代谢指标有影响的基础疾病等。本研究通过石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会审批(伦理号：2019-129-01)。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2观察指标收集并分析纳入研究对象的年龄、绝经年限、体重指数(BMI)和腰臀比(WHR)等基线资料；罗氏全自动生化分析仪(型号 Modular DPP-H7600)测得钙(Ca)、磷(P)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)；双能X线骨密度仪(DEXA)测定骨密度(L1-4、FN)。

1.3LRP5、LRP6基因测定采用DNA提取试剂盒从患者血液中提取基因组DNA[赛默飞世纪科技(中国)设备有限公司]，检测DNA的浓度及纯度。采用飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight，MALDI-TOF)进行分型检测。测定LRP5、LRP6基因SNP位点多态性及基因型分布频率。各位点引物见表1。

1.4统计学分析应用SPSS 22.0软件进行数据分析。对样本进行正态性检验。非正态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，组间比较采用秩和检验；采用χ2检验判断LRP5、LRP6基因是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，以及组间基因型及基因分布频率。Logistic回归分析及多因子降维分析基因多态性与ABM易感性、LRP5、LRP6基因SNP基因-基因、基因-年龄、基因-绝经年限间的交互作用，以OR(95%CI)表示。应用多因子降维法，进行交叉验证一致性及检验精确度进行验证。所有模型均进行置换检验1000次。所有检验均为双侧检验。以P≤0.05为差异具有统计学意义。

表 1 各位点引物及PCR产物

2 结 果

2.1 组间基线资料的比较此次研究共纳入272例研究对象，其中ABM组166例、对照组106例。与对照组相比，ABM组的年龄和绝经年限较高(P<0.05)，BMD(L1-4、FN)较低(P<0.01)。见表2。

表 2 各组绝经后女性患者一般资料的比较

2.2Hardy- Weinberg遗传平衡及ABM易感性分析在对照组中进行Hardy-Weinberg平衡检验。LRP5基因rs10743980、rs2306862位点和LRP6 基因rs10743980、rs2302685位点的基因型分布频率均与遗传平衡相符(P>0.05)。Logistic回归分析显示，LRP5基因rs2306862位点CT 、CT/TT 基因型患ABM的风险高于CC基因型(OR=2.353，95%CI=1.039～6.186；OR=2.434，95%CI=1.071，5.531；P<0.05)；LRP6基因rs2302685位点TC基因型患ABM的风险高于TT基因型(OR=2.951，95%CI=1.030～8.457，P<0.05)。余各SNP位点未见明显异常(P>0.05)。见表3。

表 3 LRP5、LRP6基因位点基因型与ABM易感性的二元Logistic回归分析[n(%)]

2.3LRP5、LRP6基因位点交互作用以是否有ABM为因变量，以4个SNP位点作为自变量(0=无风险等位基因，1=1个风险等位基因，2=2个风险等位基因)。在2位点中，rs2306862&rs10743980基因位点的多态性与ABM的发生存在协同作用，是ABM发生的危险性因素(OR=1.462，95%CI：1.128～1.895，P<0.05)； 在3位点中，rs41494349&rs2302685&rs10743980基因多态性与ABM的发生存在协同作用，ABM发生的危险性因素(OR=1.504，95%CI：1.092～2.073，P<0.05)。其余位点基因多态性与ABM的发生均未见明显的交互作用(P>0.05)。见表4。

2.4LRP5、LRP6基因位点-年龄、绝经年限间的交互作用

2.4.1LRP5、LRP6基因位点-年龄间的交互作用在以上有交互作用的位点中，调整绝经年限的协变量。在1位点中，rs2306862、rs2302685位点的多态性&年龄与ABM的发生存在协同作用，是ABM发生的危险性因素(OR=1.010，95%CI：1.003～1.017，P<0.05)；OR=1.016，95%CI：1.004～1.028，P<0.05)。在3位点中，rs41494349&rs2302685&rs10743980位点多态性&年龄与ABM的发生存在协同作用，ABM发生的危险性因素(OR=1.005，95%CI：1.002～1.008，P<0.05)。其余位点基因多态性&年龄与ABM的发生均未见明显的交互作用(P>0.05)。见表5。

2.4.2LRP5、LRP6基因位点-绝经年限间的交互作用在以上有交互作用的位点中，调整年龄的协变量。均未发现各位点基因多态性&绝经年限与ABM的发生存在交互作用(P>0.05)。见表6。

表 4 LRP5、LRP6基因位点间的交互作用

表 5 LRP5、LRP6基因位点-年龄间的交互作用

表 6 LRP5、LRP6基因位点-绝经年限间的交互作用

3 讨 论

OP是以BMD降低为主要表现，严重威胁居民健康的一种慢性代谢性疾病，OP后骨折的风险大大增加[8]。随着基因组学的发展，尤其是近年来人们越来越关注精准医学，基因多态性与OP的发生密切相关。因其对OP的发生、发展和不同治疗手段的反应明显，故寻找与OP发生发展相关的多态性基因位点具有重要意义[9]。60%～80%的BMD变异性由遗传因素决定；但对于OP高峰期的遗传影响尚不明确[9]。补充钙剂仅能短暂增加BMD水平，缓解患者的骨痛症状，但无法从根本上改善患者的疾病状态，且药物治疗后骨量的流失依然会继续进展[9]。目前对于LRP5/6基因的研究有望于精准化治疗，从根本上改善预后。

LRP5/6是组成Wnt/β-catenin信号通路的跨膜受体蛋白，其编码的蛋白属于Wnt配体的共同受体[13]。LRP5/6受体蛋白与下游β-catenin结合，促进骨形成，抑制骨吸收。LRP5/6基因突变会导致Wnt信号通路失去对细胞的调控作用[14]。本研究发现，LRP5基因rs2306862位点CT 、CT/TT 基因型患ABM的风险高于CC基因型，说明突变的等位基因T与ABM的易感性相关；LRP6基因rs2302685位点TC基因型患ABM的风险高于TT基因型，同样突变的等位基因C也可增加ABM的风险。AI等[15]的研究成果发现，罕见的功能缺失的LRP5突变导致OP，LRP5基因突变能够促进DKK1竞争性的与LRP5/6 受体结合，从而阻止Wnt/β-catenin 信号的传导。其研究结论与本研究一致。Ligdle等[16]研究了成骨细胞中LRP5和LRP6的缺失，删除成骨细胞中的LRP6可降低小梁室中骨纤维结构的形成。在Riancho等[17]对欧洲地区绝经后女性LRP6基因rs2302685及rs11054704位点研究发现其多态性参与了BMD的降低。而Nima等[18]的研究同样发现LRP6基因rs2302685位点CC基因型个体的粗隆间骨密度明显高于TT/CT基因型个体。动物实验同样发现，LRP5/6是功能重叠的同源性受体，在小鼠的胚胎发育中，这2种蛋白都通过Wnt信号刺激出生后的骨获取[10-11]，LRP6-/-小鼠出生时会因中轴骨骼和肢体缺损而死亡，而成年LRP5-/-小鼠导致OP[12]。以上研究结果与本研究结果相一致。

复杂疾病的发生多由遗传和环境因素共同决定，其中存在基因-基因的交互作用，暗示了其致病效应上的协同性。这种协同性表现在易感人群中具有统计学关联性。本研究探究LRP5/6基因各位点的交互作用发现rs2306862&rs10743980、rs41494349&rs2302685&rs10743980基因位点的多态性与ABM的发生存在协同作用，是ABM发生的危险性因素。动物实验表明，同时携带LRP5和LRP6杂合突变的小鼠可以降低BMD，导致肢体畸形[19]。这表明LRP5和LRP6在肢体发育和BMD获得过程中存在相互作用。LRP5和LRP6突变体在24周时皮质骨面积、皮质厚度和极性惯性矩均降低。这两个辅助受体的缺失导致了患有OP表型的小鼠的早期死亡[20]。Van Meurs等[21]同样研究发现LRP5、LRP6基因共同在骨代谢和骨折发挥作用。以上数据表明，OP的发病风险可能会因基因多态性而改变，且其对OP的易感性相互作用。疾病的发生同样也需要环境因素的参与，其表现为基因-环境之间的交互作用，rs2306862、rs2302685、rs41494349&rs2302685&rs10743980位点的多态性&年龄与ABM的发生存在协同作用，是ABM发生的危险性因素。年龄作为OP发病的独立危险因素已得到公认，随着年龄的增加，OP的患病率逐年递增。但本研究未得到ABM发病风险与绝经年限之间的关系，其原因可能：①女性在绝经后雌激素水平明显下降，早期可引起BMD代偿性的升高，从而掩盖了基因交互作用对其的影响。②OP是一个基因及环境多重因素相互作用的疾病，在激活Wnt/β-catenin信号传导的同时，也会应激性激活OPG/RANK/RANKL相关的成骨细胞通路，通过代偿性刺激成骨细胞形成，而补充破骨细胞的凋亡。③本文研究Wnt信号通路中LRP5/6互相协同作用的2个基因不同位点的多态性对ABM的影响，明确了LRP5/6基因位点多态性在ABM发生上存在交互作用。但同一基因上位点不同，对不同的环境因素反应也不同。

本研究也存在一定的不足：①本研究应进一步多中心、扩大样本量进一步证实；②研究应包括更多的LRP5、LRP6基因SNP位点；③影响BMD降低的机制错综复杂，在接下来的研究中应更多的纳入影响BMD的环境因素。

当前OP的基因治疗还多停留在动物实验。主要研究方法是将目的基因转入相应器官或组织，然后在体细胞内诱导目的基因的表达，从而观察骨细胞及骨小梁的形成。寻找新的基因以及更理想的基因位点是进一步研究的重点；而基因治疗与传统治疗相结合也将更加有助于临床治疗。综上所述，LRP5和LRP6基因有望成为OP基因治疗的新靶点。