曲美他嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机制

鲁成昊，张成鑫，郭志祥，葛圣林

0 引 言

冠心病是发病率、致残率、死亡率均较高的心血管疾病[1]。冠脉血运重建技术可及时恢复患者心肌血流灌注，减轻缺血所致的损伤及坏死。但是心肌缺血再灌注后将导致血管内皮细胞损伤，引发心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reper-fusion，MI/R)，进而导致室性心动过速、心室颤动等并发症，是导致缺血再灌注期间患者猝死的重要原因[2]。因此，寻找安全、有效地减轻MI/R的治疗方式，对于改善冠心病患者预后意义重大。曲美他嗪是一种代谢调节剂，可降低血管阻力、抗缺血及保护心肌细胞，乔锐等[3]认为其对缺血再灌注大鼠离体心脏具有保护作用。此外，也有国外学者将替莫唑胺用于心绞痛的治疗，提示其在治疗心脏系统疾病方面的作用[4]。然而，目前关于曲美他嗪对MI/R的干预作用研究较少，且机制尚不明确。本研究通过建立MI/R大鼠模型，观察曲美他嗪对其治疗作用，并分析可能机制，为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料选取50只SD雄性大鼠，6周龄，体重(200±20)g，购自北京维通达生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0002。盐酸曲美他嗪片购自北京万生药业有限责任公司，国药准字H20065167；Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导及转录激活子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信号通路抑制剂AG490购自美国Med Chem Express公司；Tunel细胞凋亡原位检测试剂盒购自上海臻诺生物科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)试剂盒购自上海恒远生化试剂有限公司；HE染色试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司；兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3一抗购自美国Abcam公司。仪器AU 5800全自动生化分析仪购自美国Beckman Coulter公司；Synergy-HD显微镜购自日本东芝株式会社；TY-80B电泳仪购自南京普阳科学仪器研究所；WD-9413D型一体式凝胶成像系统购自北京六一生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1建立MI/R模型大鼠2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，气管插管，与呼吸机连接，左侧第3至4肋间切口，开胸暴露心脏，在肺动脉圆锥与左心耳之间的左心耳根部下行2 mm位置进带线缝合针，结扎左前降支与少量心肌组织，血管钳将胸腔夹紧、闭合。缺血30 min，再灌注120 min，建立MI/R模型[5]。建模成功标志：心电图显示ST段提高，缺血30 min，再灌注120 min恢复冠脉血流后，抬高的ST段下降>1/2。

1.2.2分组及干预方式40只大鼠中随机抽取10只仅开胸后缝合，不结扎冠状动脉，为对照组。其余30只建立MI/R模型，随机分为MI/R组、曲美他嗪组、曲美他嗪+AG490组，建模均成功，每组10只。曲美他嗪组在缺血30 min时尾静脉注射曲美他嗪葡萄糖溶液，剂量2 mg·kg-1，再灌注120 min；曲美他嗪+AG490组在缺血30 min时尾静脉注射曲美他嗪葡萄糖溶液，剂量2 mg·kg-1，并腹腔注射AG490 DMSO溶液，剂量5 mg·kg-1，再灌注120 min；对照组、MI/R组尾静脉注射等体积葡萄糖溶液，腹腔注射等体积DMSO溶液[6]。均为一次性给药。

1.2.3组织取材再灌注120 min后脱颈处死大鼠，分离心脏，等渗盐水冲洗干净，去除脂肪及心房组织，将左心室心肌组织分成两份，一份冷冻保存用于氧化应激指标及蛋白检测；一份采用4%多聚甲醛固定，常规脱水、包埋，以病理切片机制作成5 μm连续切片，

1.2.4氧化应激指标检测取冷冻心肌组织，充分研磨匀浆后，离心取上清。采用硫代巴比妥法检测MDA含量，黄嘌呤氧化酶法检测SOD含量[7]。严格根据试剂盒说明书设计实验流程。

1.2.5Tunel染色法检测心肌组织细胞凋亡率取心肌组织切片，加入Tunel反应混合液，37 ℃湿盒中孵育60 s，PBS冲洗，加入POD转化剂，同条件孵育30 s，PBS冲洗，DAB法显色，室温孵育3 s，PBS冲洗，苏木精复染，脱水，干燥，中性树胶封片，显微镜下观察细胞凋亡情况[8]。细胞核被染为棕色、棕黑色为阳性，凋亡率=阳性细胞数/细胞总数×100%。每张切片任选5个不相邻视野计数，求均值。

1.2.6HE染色法观察心肌组织病理学变化取心肌组织切片，冲洗60 s，苏木精染液染色5 min，冲洗，滴入1%盐酸酒精，冲洗2 s，促蓝液反蓝，冲洗15 s，1%伊红染液染色30 s，自来水略洗，使用梯度乙醇脱水，二甲苯透明2次，每次3 s，中性树胶封固，显微镜下观察病理变化[9]。

1.2.7免疫印迹法检测心肌组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达量取冷冻保存的心肌组织，RIPA裂解液裂解，离心取上清，BCA试剂盒定量蛋白浓度。取30 μg待测样本上样，沸水浴5 min，恒压下经10% SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳后湿转至膜，室温下封闭液封闭2 h，加入兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3一抗(1 ∶ 500)，4 ℃摇床孵育过夜，洗涤，加入山羊抗兔二抗(1 ∶ 2000)，室温孵育1 h，暗室中光、显影、定影，凝胶成像系统扫描，目的蛋白表达量以其条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值表示[10]。

2 结 果

2.1 心肌组织MDA、SOD含量与对照组、曲美他嗪组比较，MI/R组心肌组织MDA含量升高，SOD含量降低(P<0.05)；与曲美他嗪组比较，曲美他嗪+AG490组心肌组织MDA含量升高，SOD含量降低(P<0.05)。见表1。

表 1 各组大鼠心肌组织MDA、SOD含量比较

2.2心肌组织细胞凋亡率Tunel染色结果显示，与对照组、曲美他嗪组心肌组织细胞凋亡率[(6.87±0.82)%、(12.07±2.30)%]比较，MI/R组[(23.10±4.77)%]明显升高(P<0.05)；与曲美他嗪组比较，曲美他嗪+AG490组心肌组织细胞凋亡率[(16.61±3.12)%]明显升高(P<0.05)。

2.3心肌组织病理变化HE染色结果显示，对照组心肌纤维排列整齐、致密，心肌横纹清晰；MI/R组心肌纤维排列松散、紊乱，心肌细胞变性、坏死，部分细胞核溶解、碎裂；心肌纤维断裂、溶解，间质水肿，可观察到较多炎性细胞浸润；曲美他嗪组、曲美他嗪+AG490组心肌纤维排列较MI/R组整齐，心肌细胞形态结构损伤减轻，部分心肌纤维断裂、溶解，其中曲美他嗪组对病理变化的改善效果优于曲美他嗪+AG490组。见图1。

a:对照组; b:MI/R组; c:曲美他嗪组; d:曲美他嗪+AG490组

2.4心肌组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比较与MI/R组比较，曲美他嗪组心肌组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3明显升高(P<0.05)，对照组明显降低(P<0.05)；与曲美他嗪组比较，曲美他嗪+AG490组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3明显降低(P<0.05)。见表2，图2。

表 2 各组大鼠心肌组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比较

1:对照组; 2:MI/R组; 3:曲美他嗪组; 4:曲美他嗪+AG490组

3 讨 论

MI/R发生的机制复杂，目前认为与线粒体损伤与能量耗竭、氧化应激、氧自由基、钙超载、炎症信号激活、心肌细胞凋亡与坏死等有关[11-12]。现代医学已提出缺血后适应、远程缺血处理、药物后处理、抗氧化应激及缓解钙离子超载等多种治疗MI/R的方式，但尚未成熟，仍需持续探索安全、有效的干预方式[13]。

研究表现，在MI/R初期将出现强烈的氧化应激反应，活性氧可直接损伤细胞膜，并上调促氧化酶基因表达上调并增强其活性，导致心肌细胞凋亡或激活氧化还原信号途径导致心肌细胞凋亡，并引发脂质过氧化作用，产生包括MDA在内的脂质过氧化物[14]。本研究结果显示，与MI/R组比较，曲美他嗪组心肌组织MDA含量及细胞凋亡率均降低，SOD含量增加，提示曲美他嗪可减轻心肌氧化应激反应，并减少心肌细胞凋亡。曲美他嗪可降低3-酮基辅酶A活性，减少游离脂肪酸β氧化，并诱导心肌葡萄糖氧化，减少心肌耗氧量；促进冠脉及周围循环血量的增加，减轻心肌缺血所致的细胞内酸中毒，改善线粒体功能，从而发挥心肌保护作用。Amini等[15]研究发现，I/R是急性肾衰的主要原因，其可损伤远端器官尤其是心脏，而曲美他嗪可发挥对心肌损伤的远距离保护作用，与本研究结果具有一致性，分析原因与曲美他嗪的抑制脂质过氧化物酶和增强抗氧化活性作用有关。

JAK2/STAT3信号通路是调节细胞增殖分化、凋亡、免疫、炎症等多种生理过程的关键通路。有研究发现[16-17]，早期再灌注损伤、钙离子超载将导致线粒体通透性转换孔开放过度，引发线粒体肿胀及细胞膜破裂，细胞色素C及凋亡诱导因子大量释放，启动细胞凋亡级联反应，并通过激活JAK2/STAT3信号通路保护心肌组织。AG490是JAK2/STAT3信号通路的特异性抑制剂，可通过阻断位于JAK特异位点上的丝氨酸或酪氨酸磷酸化，抑制下游激酶及其生理、病理效应。本研究结果显示，与对照组比较，MI/R组心肌组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3升高，采用曲美他嗪干预可进一步升高p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3，且曲美他嗪联合AG490可减弱曲美他嗪对MI/R大鼠的治疗作用。有学者报道显示，JAK2/STAT3通路在糖尿病大鼠MI/R中活性被抑制，针对性处理后其心肌梗死面积缩小，且JAK2/STAT3通路活性增强[18]，本研究结果与其结合提示曲美他嗪对MI/R的心肌保护作用可能通过激活JAK2/STAT3通路来实现。

综上所述，曲美他嗪可减轻MI/R大鼠氧化应激反应，减少心肌细胞凋亡，其作用机制可能与激活JAK2/STAT3信号通路有关。关于曲美他嗪的心肌保护作用是否存在其他作用机制仍需进一步探索。