超高效液相色谱法测定硫酸吗啡原料药中的伪吗啡、N-氧化吗啡和可待因

2021-11-25杨冬芝

理化检验-化学分册 2021年11期

钱雯,杨冬芝

(徐州医科大学药学院,徐州 221004)

吗啡是具有菲环结构的生物碱,含有酚羟基和叔胺基基团,是两性化合物。吗啡与酸形成盐类化合物,常见的有硫酸吗啡和盐酸吗啡。硫酸吗啡是一种强效止痛药,可激动中枢神经系统的阿片受体,选择性地抑制兴奋性神经冲动传递,解除机体对疼痛的感受[1],广泛应用于缓解癌症晚期病人的癌痛及手术阵痛和控制慢性疼痛[2-4]。硫酸吗啡制剂主要有注射液、片剂和缓释片。

吗啡及其盐类化合物在光照条件下易被空气氧化,生成毒性较大的伪吗啡[结构见图1(a)]和N-氧化吗啡[结构见图1(b)][5-7]。除此之外,在从阿片中提取吗啡的过程中,还会由于分离纯化不完全而引入杂质可待因[结构见图1(c)][8-9]。原料药的纯度和杂质含量会影响制剂药品的药效,甚至引起不良反应,因此在用硫酸吗啡原料制备硫酸吗啡制剂时,必须严控伪吗啡、N-氧化吗啡和可待因的含量。

图1 伪吗啡、N-氧化吗啡和可待因的结构Fig.1 Structures of 2,2-bimorphine,morphine N-oxide and codeine

目前,《中华人民共和国药典》(2020年版)(简称Ch P 2020)二部中虽然收录了硫酸吗啡原料药,但缺乏有关物质检测项。该药典关于硫酸吗啡缓释片的有关物质的检测方法中,仅给出了硫酸吗啡的保留时间(约11 min),缺少伪吗啡、N-氧化吗啡和可待因定性参数和校正因子的描述。美国药典USP43和欧洲药典EP9.0规定了吗啡及吗啡制剂的有关物质的检测方法(高效液相色谱法),但该检测方法进样时间较长(60 min),不利于样品的大批量分析和日常质量研究。近期的相关文献在考察吗啡及其制剂的质量及稳定性时仅考察了吗啡含量的变化[10-14],并没有关注伪吗啡、N-氧化吗啡和可待因。

本工作通过优化色谱条件,建立了超高效液相色谱法(UHPLC)测定硫酸吗啡原料药中的伪吗啡、N-氧化吗啡和可待因含量的方法,以期为硫酸吗啡的质量控制提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

H-Class型超高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器(DAD)和Empower3色谱工作站;CPA225D型电子天平;FE28型pH 计。

混合标准溶液:取适量硫酸吗啡对照品、100 mg·L－1N-氧化吗啡标准溶液、伪吗啡对照品和磷酸可待因对照品,用30%(体积分数,下同)甲醇溶液溶解并稀释制成10.00 mg·L－1的混合标准溶液。

系统适用性溶液:取硫酸吗啡原料药约10 mg和100 mg·L－1N-氧化吗啡标准溶液1 mL,用30%甲醇溶液溶解并定容至5 mL。

硫酸吗啡对照品纯度为87.3%;N-氧化吗啡标准溶液的质量浓度为100 mg·L－1;伪吗啡对照品纯度为91.5%;磷酸可待因对照品纯度为96.9%;甲醇、乙腈和庚烷磺酸钠均为色谱纯;其余试剂为分析纯;试验用水为超纯水。

硫酸吗啡原料药的批号分别为20180304、20170401、20140707。

1.2 仪器工作条件

Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),柱温25 ℃;流量0.2 mL·min－1;检测波长230 nm;进样量1μL。流动相A 为含2.02 g·L－1庚烷磺酸钠的磷酸溶液(pH 2.5),B 为甲醇;梯度洗脱:0～15 min 时,A 由70%降至50%,保持2 min;17～18 min 时,A 由50%升至70%,保持7 min。

1.3 试验方法

取硫酸吗啡原料药约20 mg,用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,得到供试品溶液,供UHPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相

ChP 2020中测定硫酸吗啡缓释片有关物质含量的方法为等度高效液相色谱法,采用的流动相体系为甲醇-含庚烷磺酸钠的乙酸溶液(pH 2.5)。基于此,试验选择甲醇-含庚烷磺酸钠的磷酸溶液(pH 2.5)为流动相,用磷酸代替乙酸的原因为磷酸的截止波长更小,基线噪声更小,且杂质的测定下限更低[15]。

2.1.2 检测波长

ChP 2020中测定硫酸吗啡缓释片有关物质含量的方法选用的检测波长为233 nm,但本试验用DAD 在波长210～400 nm 内扫描时发现,硫酸吗啡的最大吸收波长为285 nm,N-氧化吗啡的最大吸收波长分别为210,285 nm,可待因的最大吸收波长分别为211,285 nm,伪吗啡的最大吸收波长为230 nm。综合考虑各物质的响应强度,试验选择的检测波长为230 nm。

2.1.3 定性方法和梯度洗脱程序

参考ChP 2020中测定硫酸吗啡缓释片有关物质含量的方法,比对供试品溶液和混合标准溶液的色谱峰,以保留时间(硫酸吗啡、N-氧化吗啡、伪吗啡和可待因的保留时间分别为4.5,4.3,11.4,6.8 min)和紫外吸收特征峰对供试品溶液中N-氧化吗啡、伪吗啡和可待因进行定性。

ChP 2020采用的洗脱方法为等度洗脱,伪吗啡的出峰时间约为吗啡峰的4.5倍,且峰展宽现象严重,柱效低,降低了伪吗啡的检出灵敏度。经过反复试验,本方法选择以梯度洗脱程序进行分离,可使伪吗啡出峰时间提前,峰形变尖,灵敏度变高。

2.2 专属性试验

吗啡(硫酸吗啡在色谱体系中即为吗啡)与N-氧化吗啡峰的出峰时间比较接近,故按照仪器工作条件测定系统适用性溶液,以考察本方法对这两种物质的分离效果,色谱图见图2。

图2 系统适用性溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of system suitability solution

由图2可知,吗啡与N-氧化吗啡峰的分离度为1.8,大于1.5,说明二者可实现完全分离。

为了考察方法在不同降解条件下的适用性,取批号为20180304的硫酸吗啡样品10 mg各6份,分别在6组条件下进行降解试验:①直接用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作为不降解组;②加入0.1 mol·L－1盐酸溶液1 mL,室温放置2 h后,用0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液1 mL 中和,用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作为酸降解组;③加入0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液1 mL,室温放置2 h后,用0.1 mol·L－1盐酸溶液1 mL中和,用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作为碱降解组;④加入30%(质量分数)过氧化氢溶液1 mL,放置30 min,用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作为氧化降解组;⑤先用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,再在60 ℃水浴中加热2 h,作为高温降解组;⑥先用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,再在(4 500±500)lx 下光照48 h,作为光照降解组。上述所得溶液按照仪器工作条件测定,结果见图3。

图3 样品经不同条件降解后的色谱图Fig.3 Chromatograms of samples degraded under different conditions

由图3可知,不降解和在不同降解条件下硫酸吗啡原料药均会生成伪吗啡,生成含量按照从大到小的顺序依次为氧化降解组、光照降解组、碱降解组、酸降解组、高温降解组和不降解组;在氧化条件下,伪吗啡还会生成降解杂质N-氧化吗啡(曲线d);生成的降解杂质与主峰的分离效果均较好,说明本方法具有良好的专属性。

2.3 色谱行为

按照仪器工作条件测定混合标准溶液,所得色谱图见图4。

图4 混合标准溶液的色谱图Fig.4 Chromatogram of the mixed standard solution

由图4可知,N-氧化吗啡、吗啡、伪吗啡和可待因色谱峰峰形良好,且可实现完全分离。

当N-氧化吗啡、伪吗啡和可待因对照品或标准溶液无法获得时,可采用加校正因子的主成分自身对照法计算N-氧化吗啡、伪吗啡和可待因含量(乘以校正因子)。校正因子(f)为硫酸吗啡和各杂质的标准曲线斜率之比,N-氧化吗啡、伪吗啡和可待因相对于硫酸吗啡的校正因子分别为1.03、0.24和0.93。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

用30%甲醇溶液分别配制30.00 mg·L－1的硫酸吗啡、N-氧化吗啡、伪吗啡和可待因标准溶液。分别取硫酸吗啡、N-氧化吗啡、伪吗啡和可待因标准溶液各1,2,3,4,5,8,10 mL,用30%甲醇溶液定容至10 mL,制得3.00,6.00,9.00,12.00,15.00,24.00,30.00 mg·L－1硫酸吗啡和各杂质标准溶液系列,按照仪器工作条件测定,4种目标物标准曲线的线性范围均为3.00～30.00 mg·L－1,其他线性参数见表1。

分别以3 倍、10 倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表1。