超高效液相色谱-串联质谱法测定3种常见淋洗类化妆品中2种防腐剂

卢端萍,陈 硕,程佳华,谢宋阳,王 勇

(福建省食品药品质量检验研究院,福州 350001)

为了使化妆品在生产、使用和保存过程中免受微生物污染,保证化妆品的有效性,生产过程中往往需要加入防腐剂,甲基异噻唑啉酮(MI)和卡松由于水溶性较好,常用于洗发水、沐浴露、洁面乳等淋洗类化妆品中。卡松是甲基氯异噻唑啉酮(MCI)、MI与氯化镁及硝酸镁的混合物(MCI和MI质量比为3∶1)。MI和MCI具有较强的致敏性,长期使用含高添加量的MI和MCI的化妆品会引起接触性皮炎[1-4]。欧盟(EU)2017/1224 公告对化妆品法规EC 1223/2009附录V 进行修订,规定MI仅可用于淋洗类化妆品,使用限量由0.01%降至0.001 5%。我国《化妆品安全技术规范》2015年版[5]中规定:化妆品中不能单独使用MCI,MI最大允许添加量为0.01%;卡松仅能用于淋洗类化妆品,且不能和MI同时使用,最大允许添加量为0.001 5%。因此,有必要对化妆品中MI或卡松的含量进行监控。相关文献中的MI和MCI测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[6-11]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[12-16]、气相色谱法(GC)[17-18]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[19]。《化妆品安全技术规范》中规定的MI及MCI的测定方法为HPLC,两种成分的测定下限均为0.001 3%(即13μg·g-1),与卡松的最大允许添加量0.001 5%(即15μg·g－1)接近,说明该方法的灵敏度较低,同时,MI和MCI的出峰时间较早,容易被样品中极性较大的杂质干扰,无法被准确地测定。淋洗类化妆品中含有大量的表面活性剂,成分较为复杂,且卡松的添加量较低,因此需要建立一个高效、灵敏、准确的测定方法。本工作根据淋洗类化妆品的特性,对前处理、色谱条件、基质效应等进行考察,建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定90批淋洗类化妆品中MI和MCI含量的方法,以期为化妆品中MI和MCI含量的准确测定提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色谱仪,配XEVO TQ-S型三重四极杆质谱仪;XP 205型电子天平。

单标准储备溶液:称取适量MI、MCI,加甲醇溶解并稀释配制成40 mg·L－1的单标准储备溶液。

混合标准溶液:分别移取适量MI、MCI单标准储备溶液1,2 mL于100 mL容量瓶中,用10%(体积分数,下同)甲醇溶液稀释配制成400,800μg·L－1的混合标准溶液。

混合标准溶液系列:移取适量混合标准溶液,用10%甲醇溶液逐级稀释配制成含0.8,2,4,8,20,40,80,120,160,200μg·L－1MI和1.6,4,8,16,40,80,160,240,320,400μg·L－1MCI的混合标准溶液系列。

MI纯度为98.6%;MCI纯度为99.9%;甲醇为色谱纯,其余试剂为分析纯;试验用水为一级水。

试验样品为近两年福建省监督抽检样品,共90批,其中沐浴类产品48批(含婴童类产品13批和沐浴洗发类产品1批)、洗发类产品33批(含婴童类产品4批)、洁面类产品9批。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),柱 温25 ℃;流量0.3 mL·min－1;进样量1μL;流动相A 为甲醇,B为0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液;按表1程序进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源正离子模式(ESI＋);毛细管电压0.5 kV;脱溶剂温度500 ℃;脱溶剂气流量1 000 L·h－1,锥孔反吹气流量150 L·h－1;雾化器压力0.7 MPa。多反应监测(MRM)模式分析时间从第4.5 min开始,持续到第15 min;其他质谱参数见表2,其中,“*”为定量离子。

表2 质谱参数Tab.2 MS parameters

1.3 试验方法

将0.2 g 样品置于25 mL 纳氏比色管中,加10%甲醇溶液1 mL,涡旋30 s。加入10%甲醇溶液7 mL,超声提取10 min,依次加入100 g·L－1亚铁氰化钾溶液0.2 mL 和200 g·L－1乙酸锌溶液0.2 mL,并分别混匀,用10% 甲醇溶液定容至10 mL,摇匀,静置5 min,取上清液过0.22μm 滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照试验方法分析含MI和MCI分别为40,80μg·L－1的混合标准溶液和3种不同类型的实际样品,所得总离子流色谱图见图1。

图1 混合标准溶液和3种类型样品的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of mixed standard solution and 3 types of samples

2.2 色谱柱的选择

试验考察了 Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、Waters UPLC BEH HILIC色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、Waters CORTES T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.7μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)、Agilent SB Aq色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)、Agilent Poroshell HPH-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,2.7μm)对混合标准溶液中MI和MCI的分离效果。结果显示:Waters UPLC BEH HILIC 色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)所得MI和MCI出峰时间过早;Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、Waters CORTES T3 色 谱柱(100 mm×2.1 mm,2.7μm)所得MI出峰时间较早,MCI响应值较低;Agilent SB Aq色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Agilent Poroshell HPH-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,2.7μm)所得MI及MCI的色谱峰峰形均较差,且MCI 在Agilent Poroshell HPH-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,2.7μm)上出峰时间延迟较多;Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)所得MI和MCI的出峰时间适当、色谱峰峰形较好、响应值较高,且该色谱柱耐水性好,故试验选择的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)。

2.3 流动相的选择

试验分别以甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2%(体积分数,下同)甲酸溶液、含0.2%甲酸的甲醇溶液-0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱,考察了不同流动相对混合标准溶液中MI和MCI分离效果的影响。结果显示:用以上流动相进行梯度洗脱时,MI、MCI的峰形均较好,响应值均较高且相差不大。考虑到操作的简便性,试验选择甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相。

2.4 样品前处理条件的选择

试验曾尝试先用饱和氯化钠溶液分散样品,再用乙腈萃取3 次,但在饱和氯化钠溶液中检出了MI,这是由于MI极性较大,无法完全转移至乙腈层中,导致MI提取不完全。试验又按照试验方法提取样品,并考察了不同体积分数(10%,30%,50%,100%)甲醇溶液作提取剂及不同超声提取时间(5,10,15,20 min)对样品中MI和MCI提取效果的影响。结果显示:不同体积分数甲醇溶液的提取效果无明显差别,且当超声提取时间为10 min时,样品中MI和MCI已被提取完全。从MI与MCI极性较大以及应减少有机溶剂使用的角度考虑,试验选择以10%甲醇溶液提取样品,超声提取时间为10 min。

2.5 沉淀剂用量的选择

试验以100 g·L－1亚铁氰化钾溶液和200 g·L－1乙酸锌溶液作为沉淀剂沉淀样品中的蛋白质等大分子杂质,并分别考察这2种沉淀剂用量分别为0.1,0.2 mL时的沉淀效果。结果显示:沉淀剂的用量各为0.2 mL 时,离心后所得的沉淀较多,但MI、MCI的含量与0.1 mL时的一致。考虑到沉淀过程应尽可能除去较多杂质,试验选择2种沉淀剂的用量均为0.2 mL。

2.6 基质效应影响的消除

淋洗类化妆品中的基质比较复杂,表面活性剂等水溶性杂质容易产生基质效应,基质效应对质谱检测影响较大。考虑到MI、MCI的极性较大,在反相色谱柱上不易保留,为了延长MI、MCI的保留时间,应适当提高水相的比例,试验在梯度洗脱程序中,设置了先用0.1%甲酸溶液洗脱4.5 min这一步骤,以去除表面活性剂等水溶性杂质,且该时间段不进行质谱分析,从而降低基质效应。试验还对比了HLB固相萃取柱净化前后的基质效应,按照试验方法分析实际样品,并将得到的上清液过不同规格(60,100,200 mg)HLB固相萃取柱,结果显示:MI在60,100 mg 的HLB 固相萃取柱上较容易被洗脱,在200 mg 的HLB 固相萃取柱上保留效果较好,但过柱所得的洗脱液中MI、MCI的含量与不过柱的上清液中的一致,说明是否过柱带来的基质干扰对测定的影响较小,试验选择不净化直接测定。

2.7 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以2种化合物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表3。

分别以3 倍、10 倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表3。

表3 线性参数、检出限和测定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.8 重复性试验

按照试验方法平行测定一批沐浴类产品6次,计算测定值的相对标准偏差(RSD),MI和MCI的测定值分别为1.91,3.23μg·g－1,RSD 分别为0.70%,2.1%,表明该法重复性良好。

2.9 稳定性试验

将按照试验方法处理得到的样品溶液在室温下放置0,2,4,8,12,16,20,24 h后进样,计算得MI、MCI峰面积的RSD 分别为2.1%,3.2%,说明样品溶液在24 h内稳定。

2.10 回收试验

按照试验方法对空白沐浴露样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定3次,计算回收率,结果见表4。

表4 回收试验结果Tab.4 Results of test for recovery

由表4 可知:MI、MCI 的回收率分别为94.3%～107%和93.4%～106%,说明本方法的回收率较好。

2.11 样品分析

按照试验方法分析90批淋洗类化妆品,并与标签标识符合情况进行比对,同时用《化妆品安全技术规范》中的HPLC 测定了抽检的15 批产品中的MI、MCI含量,并同本方法进行比对,结果见表5。其中编号为61的样品MI色谱峰附近有干扰峰,无法被准确测定。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of samples

表5(续)

表5(续)

由表5可知,针对沐浴类产品:MI在成人、婴童类产品中的检出数量分别为28,10个,其含量超过欧盟化妆品法规EC 1223/2009 规定的限值(0.001 5%)的产品分别为4,3个,除1个婴童类产品中MI的检出量为98.2μg·g－1,接近我国《化妆品安全技术规范》规定的限值(0.01%)外,其他产品中MI含量均未超过限值;MCI在成人、婴童产品中的检出数量分别为17,7 个,最大检出量分别为15.7,9.53μg·g－1。针对洗发类产品:MI在成人、婴童类产品中的检出数量分别为25,2个,其含量超过欧盟化妆品法规EC 1223/2009 规定的限值(0.001 5%)的产品分别为3,1 个,但均未超过《化妆品安全技术规范》规定的限值;MCI在成人、婴童类产品中的检出数量分别为21,1个,最大检出量分别为15.2,0.16μg·g－1。针对洁面类产品:MI的检出数量为3个,最大检出量为2.67μg·g－1,未超过欧盟化妆品法规EC 1223/2009 及《化妆品安全技术规范》规定的限值;MCI的检出数量为2个,最大检出量为3.64μg·g－1。共有48批产品同时检出MCI和MI,从二者的含量比的分布来看:33批产品MCI含量较MI的高,二者含量比为1.2∶1～3.7∶1,比值约为3∶1(2.6∶1～3.4∶1,依据GB/T 29666－2013《化妆品用防腐剂 甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮与氯化镁及硝酸镁的混合物》确定)的产品仅9批,符合《化妆品安全技术规范》卡松中MCI与MI质量比为3∶1的要求且未超过规定的限值(0.001 5%);15批产品中MI含量较MCI的高,MCI和MI的含量比为1∶1.1～1∶383,其中有8批产品MI含量比MCI高5倍以上,怀疑这些产品同时添加了卡松与MI。从与标签标识符合情况来看,有25批(约28%)产品检出情况与标签标识的不一致:37批产品标签同时标识了MI及MCI,但有3批产品未检出MCI;14批产品标签只标识了MI,但其中有5批产品还检出了MCI;39批产品标签未标识MI及MCI,但有9批产品同时检出了MI及MCI,8批产品检出了MI;涉及的产品包括沐浴类产品15批,洗发类产品10批。从方法比对结果来看:2种方法的测定值基本一致,但规范方法大多数测定值小于其测定下限(13.00μg·g－1)。

本工作建立了UHPLC-MS/MS测定淋洗类化妆品中MI和MCI的方法,并对实际样品中MI及卡松的可能添加及与标签标识符合情况进行分析。该方法准确度较高、专属性较好、检出限较低,可用于淋洗类化妆品中MI和MCI含量的测定。