超高效合相色谱法拆分和测定婴幼儿配方乳粉中肉碱对映体

张文华,谢 文,侯建波,张雅琴,汪 鹏,胡晓莉,徐敦明

(1.杭州海关技术中心,杭州 310016;2.浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州 310016;3.厦门海关技术中心,厦门 361026)

肉碱化学名称为β-羟基-γ-三甲胺基丁酸(结构见图1),是一种类氨基酸化合物。哺乳动物体内的肉碱可以通过赖氨酸及蛋氨酸天然合成,参与体内脂肪代谢生成能量的过程。肉碱中有1个手性碳原子,存在一对对映体,即右旋肉碱(D-肉碱)与左旋肉碱(L-肉碱)。

图1 肉碱的化学结构Fig.1 Chemical structure of carnitine

两种肉碱对映体的生物活性差异较大,其中D-肉碱没有功效,大剂量使用会对人体健康产生危害[1],L-肉碱具有功效,是哺乳动物体内能量代谢必需的天然物质,可以促使脂肪转化为能量。婴儿体内L-肉碱合成能力较弱,无法满足其正常代谢,因此需要在婴幼儿配方乳粉中添加L-肉碱。目前,国内L-肉碱的合成方法多为肉碱外消旋体拆分法[2-4],但当将拆分程度不完全的L-肉碱添加至婴幼儿配方乳粉中时,可能导致乳粉质量不达标,因此有必要建立一种拆分肉碱外消旋体和测定婴幼儿配方乳粉中肉碱对映体含量的方法。

肉碱对映体的测定方法主要有高效液相色谱-串联质谱法[5-8]、高效液相色谱法[9-12]、分光光度法[13-15]等。但这些方法通常存在有机试剂消耗量大、分离度差、分离时间长等问题。而新兴的超高效合相色谱法(UPC2)通常以超临界二氧化碳和少量有机溶剂(无水乙醇、甲醇等)的混合物为流动相,调节系统背压、色谱柱温度及有机溶剂的比例使流动相的密度和极性发生改变,从而达到精密控制目标物分离的目的,在手性分离的应用中具有明显优势,已被成功应用于双酚类化合物[16]、三唑类农药[17]、邻苯二甲酸酯[18]、3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯[19]等结构类似物的分析,但在肉碱对映体的拆分和含量测定方面还未见报道。

本工作建立了一种基于UPC2拆分和测定两种肉碱对映体的方法,并应用于婴幼儿配方乳粉中肉碱的分离和含量的测定,以期为婴幼儿配方乳粉中肉碱对映体含量测定提供技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity 型超高效合相色谱仪;ELGA CLXXXUVM2型超纯水净化系统;1-16K 型台式离心机;MS2 型涡旋混匀器;R215 型旋转蒸发仪;AE260型电子天平;N-EVAPTM 111 型氮吹仪;Oasis MCX 型混合型强阳离子交换固相萃取柱(3 mL,60 mg)。

肉碱外消旋体标准储备溶液:1.0 g·L－1,称取0.01 g(精确至0.1 mg)肉碱,用无水乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中。

肉碱外消旋体标准溶液:100 mg·L－1,取适量肉碱外消旋体标准储备溶液,用无水乙醇稀释配制成100 mg·L－1的肉碱外消旋体标准溶液。

两种肉碱对映体的单标准储备溶液:1.0 g·L－1,分别称取0.01 g(精确至0.1 mg)D-肉碱和L-肉碱,用无水乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中。

两种肉碱对映体的混合标准溶液系列:取一定量的两种肉碱对映体的单标准储备溶液,用无水乙醇逐级稀释配制成0.50,1.00,2.00,5.00,20.00 mg·L－1的混合标准溶液系列。

衍生试剂溶液:4.5 g·L－1,称取0.45 gL-丙氨酸-β-萘胺,用乙腈溶解并定容至100 mL。

催化剂Ⅰ:称取0.50 g三乙胺,用三氯甲烷溶解并定容至100 mL。

催化剂Ⅱ:称取0.50 g氯甲酸丁酯,用三氯甲烷溶解并定容至100 mL。

反应终止液:50 mmol·L－1,称取0.42 g碳酸氢钠,用水溶解并定容至100 mL。

L-丙氨酸-β-萘胺、肉碱外消旋体的纯度不小于98.0%;D-肉碱和L-肉碱的纯度分别为99.8%和99.0%。

乙腈、甲醇、无水乙醇均为色谱纯;氨水、盐酸、氢氧化钾、碳酸氢钠、三氯甲烷、三乙胺、氯甲酸丁酯均为优级纯;其他所用试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱(150 mm×3.0 mm,2.5μm),填料为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯),柱温40 ℃;系统背压13.8 MPa;进样量5μL;检测波长244 nm;流动相A 为超临界二氧化碳,B 为含1%(体积分数)氨水的甲醇溶液。梯度洗脱程序:0～7 min 时,B 为10%;7～9 min时,B 由10%升至28%,保持3 min;12～13 min时,B 由28%降至10%,保持1 min;流量1.0 mL·min－1。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的提取

称取5.0 g(精确至0.01 g)婴幼儿配方乳粉样品于50 mL容量瓶中,加入0.1 mol·L－1盐酸溶液20 mL,涡旋1 min混匀,超声5 min充分溶解样品。加入1 mol·L－1氢氧化钾溶液5 mL,涡旋3 min混匀,60 ℃水浴皂化30 min,冷却至室温,加入1 mol·L－1盐酸溶液5 mL,涡旋1 min 混匀,以0.1 mol·L－1盐酸溶液定容至50 mL。取1 mL 提取液于15 mL 离心管中,加入9 mL 乙腈,涡旋1 min混匀后,移取1.5 mL 于2 mL 离心管中,在15 000 r·min－1转速下离心5 min,取上清液备用。

1.3.2 样品的净化

依次用3 mL 甲醇、3 mL 水和10 mmol·L－1盐酸溶液3 mL活化固相萃取柱。取1 mL 上清液注入活化好的固相萃取柱中,用10 mmol·L－1盐酸溶液3 mL 淋洗,弃去全部淋洗液,真空抽柱1 min,用含4%(体积分数)氨水的甲醇溶液2 mL洗脱,洗脱液收集在15 mL离心管中,在40 ℃下氮吹至近干,取残渣备用。

1.3.3 样品的衍生

在残渣中加入0.5 mL 衍生试剂溶液,超声1 min,再依次加入0.5 mL催化剂Ⅰ和0.5 mL催化剂Ⅱ,涡旋3 min混匀,在20 ℃静置60 min。加入2.0 mL反应终止液,涡旋3 min混匀,以5 000 r·min－1转速离心5 min,移取上层水相于100 mL 浓缩瓶中,于40 ℃浓缩至近干,加入1 mL无水乙醇,涡旋3 min充分溶解残渣,过0.22μm 有机滤膜,滤液供UPC2分析。

2 结果与讨论

2.1 方法的可行性

取100 mg·L－1肉碱外消旋体标准溶液0.2 mL,按照试验方法衍生并测定,并与D-肉碱和L-肉碱的色谱图进行比对,结果见图2。

图2 肉碱外消旋体、D-肉碱和L-肉碱的色谱图Fig.2 Chromatograms of carnitine racemate,D-carnitine and L-carnitine

由图2可知:两种肉碱对映体在11.0 min内实现了有效分离,经与D-肉碱和L-肉碱的色谱图的比对,确定10.5～11.0 min内出峰的两种物质分别为D-肉碱、L-肉碱。以二者各自峰面积占总峰面积的比值计算各自含量,其中D-肉碱所占比例为51.2%,L-肉碱所占比例为48.8%。

2.2 净化小柱的选择

按照试验方法考察了容量相同的Oasis WCX型混合型弱阳离子交换固相萃取柱(记为WCX 净化小柱)、Oasis HLB型聚合物固相萃取小柱(记为HLB净化小柱)、Oasis MCX 型混合型强阳离子交换固相萃取柱(记为MCX 净化小柱)对空白加标样品(加标量200 mg·kg－1)的净化效果,结果见图3。

图3 净化小柱对两种肉碱对映体净化效果的影响Fig.3 Effect of purification cartridge on the purification effect of two carnitine enantiomers

由图3可知:经过WCX 和HLB净化小柱净化后,样品溶液的色谱图中未见肉碱对映体的色谱峰,而以MCX 净化小柱净化的样品溶液的色谱图中两种肉碱对映体色谱峰的分离度较好,因此试验选择MCX 净化小柱净化样品。

2.3 衍生反应条件的选择

氯甲酸乙酯[13]、氯甲酸丁酯[20]均可用作衍生反应的催化剂,由于氯甲酸乙酯毒性强、沸点低,且不易购买,试验选择氯甲酸丁酯作衍生反应的催化剂。

试验还考察了衍生试剂溶液的用量对衍生效果的影响。取3份20.00 mg·L－1两种肉碱对映体的混合标准溶液0.5 mL于3个离心管中,吹氮至近干后,分别加入0.5 mL 不同质量浓度(4.5,9.0,13.5 g·L－1)的衍生试剂溶液,按照试验方法衍生并测定。结果显示:测定值随着衍生试剂溶液质量浓度的增加并没有明显增加,因此试验选择的衍生试剂溶液的质量浓度为4.5 g·L－1。

试验还考察了衍生温度分别为4,20,40,60℃,衍生时间分别为10,30,60,90 min时对两种肉碱对映体测定值的影响,结果见图4。

图4 衍生温度和衍生时间对两种肉碱对映体质量浓度的影响Fig.4 Effect of derivatization temperature and time on mass concentration of two carnitine enantiomers

由图4可知:两种肉碱对映体的质量浓度先随衍生温度的升高而迅速增加;当衍生温度为20 ℃时,质量浓度较大;衍生温度继续增加,质量浓度急剧减少。因此,试验选择的衍生温度为20℃。两种肉碱对映体的质量浓度先随衍生时间的延长而增加;当衍生时间不小于60 min时,质量浓度趋于稳定。因此,试验选择的衍生时间为60 min。

2.4 色谱柱的选择

两种肉碱对映体结构相似,很难进行拆分和色谱分离,因此试验分别考察了相同规格的Acquity Trefoil AMY1色谱柱、Acquity Trefoil CEL1色谱柱和Acquity Trefoil CEL2色谱柱等3种手性色谱柱对两种肉碱对映体分离效果的影响。取3 份20.00 mg·L－1两种肉碱对映体的混合标准溶液0.5 mL于3个离心管中,氮吹至近干后,按照试验方法衍生并测定,结果见图5。

图5 3种手性色谱柱对两种肉碱对映体分离效果的影响Fig.5 Effect of 3 chiral chromatographic columns on the separation effect of two carnitine enantiomers

由图5 可知:以Acquity Trefoil AMY1 色谱柱、Acquity Trefoil CEL2色谱柱分离时,两种肉碱对映体不能实现完全分离,且色谱峰峰形差;以Acquity Trefoil CEL1色谱柱分离时,分离度较好,且色谱峰峰形尖锐。因此,试验选择Acquity Trefoil CEL1色谱柱分离两种肉碱对映体。

2.5 系统背压和柱温的选择

试验采用的流动相A 为超临界二氧化碳,可通过调整系统背压和柱温改变二氧化碳的密度,进而改变其对目标物的溶解能力、洗脱能力和选择性。

首先考察了系统背压分别为10.3,13.8,17.2,20.7 MPa时对两种肉碱对映体分离效果的影响。结果显示:目标物的出峰时间随着系统背压的升高而缩短;当系统背压为10.3 MPa时,两种肉碱对映体色谱峰的展宽比较明显;当背压升高至13.8 MPa时,两种肉碱对映体的分离度较好,色谱峰峰形比较对称;当背压升高至17.2 MPa时,两种肉碱对映体的分离度降低;当背压升高至20.7 MPa时,系统出现超压报警。综合考虑色谱峰峰形及分离度,试验选择的系统背压为13.8 MPa。

Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱的最高推荐运行温度为40 ℃,而二氧化碳在温度超过31 ℃且压力超过7.38 MPa时才会进入超临界二氧化碳状态,因此试验考察了柱温分别为31,35,40℃时对两种对映体分离效果的影响,结果见图6。

由图6可知:随着柱温升高,两种肉碱异构体的分离度有所增大,出峰时间逐渐延长,这是由于随着柱温的升高,二氧化碳超临界流体的黏度降低、密度减小、溶剂化能力降低,超临界流体对目标物的溶解及交换能力减弱,目标物的出峰时间延长;当柱温为31,35 ℃时,两种肉碱对映体的分离度不佳;当柱温为40 ℃时,两种肉碱对映体的分离度较好,且在11.0 min内实现良好的基线分离。因此,试验选择的柱温为40 ℃。

图6 柱温对两种肉碱对映体分离效果的影响Fig.6 Effect of column temperature on the separation effect of two carnitine enantiomers

2.6 标准曲线和测定下限

按照仪器工作条件测定两种肉碱对映体的混合标准溶液系列,以两种肉碱对映体的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:两种肉碱对映体标准曲线的线性范围均为0.25～10.00 mg·L－1(衍生后稀释了1倍),线性回归方程分别为y＝4.607×104x－2.723×103和y＝4.800×104x－5.499×103,相关系数均为0.999 3。

按照试验方法分析空白加标样品(加标量为25 mg·kg－1),以10 倍信噪比(S/N)计算测定下限(10S/N),L-肉碱和D-肉碱的测定下限均为25 mg·kg－1。

2.7 精密度和回收试验

按照试验方法对空白样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1 可知,两种肉碱对映体的回收率为93.0%～110%,RSD 为3.9%～5.5%,符合相关标准[21]的要求。

2.8 方法比对

按照试验方法分析实际样品,并同国家标准GB 29989－2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》中分光光度法的结果进行了比对,在实际样品中均未检出D-肉碱,所检出的L-肉碱的结果见表2。

表2 方法比对试验结果Tab.2 Results of test for method comparison

由表2可知:本方法的测定值均符合食品安全国家标准GB 28050－2011《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》[22]和GB 13432－2013《食品安全国家标准 预包装特殊膳食用食品标签》[23]规定的营养成分的实际含量不小于标示值80%的要求(未标识的除外);采用F检验法比较了两种方法的显著性差异,所得p值大于0.05,说明两种方法无显著性差异,测定结果基本一致。

本工作建立了UPC2拆分并测定婴幼儿配方乳粉中D-肉碱和L-肉碱含量的方法。该方法精密度和准确度较好,可用于婴幼儿配方乳粉中的D-肉碱和L-肉碱含量的监控。