基于近红外光谱法建立的模型快速预测苗药水冬瓜叶中金丝桃苷和异槲皮苷

韩忠耀,文朝旭,李 燕,蒙慧彤,邓先扩,胡志平,卢 洋,田 浩,王万乐

(1.黔南民族医学高等专科学校 药学系,都匀 558000;2.遵义医科大学 检验医学院,遵义 563006)

水冬瓜叶为山茱萸科植物有齿鞘柄木[Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia(Harms)Hu]的干燥叶[1],具有较高的药用价值[2-3],为贵州省少数民族用药。水冬瓜叶主要含有紫丁香苷、金丝桃苷、异槲皮苷、熊果酸、7-羟基-6-甲氧基香豆素等化学成分[4-9],具有抗炎镇痛[10-11]、免疫调节[12-13]等生物活性。其中,金丝桃苷、异槲皮苷等为水冬瓜叶中主要指标性的化学成分,对评价苗药水冬瓜叶品质具有重要参考价值。

金丝桃苷和异槲皮苷的测定方法主要为高效液相色谱法,该方法检测较耗时、费力。因此,建立快速检测水冬瓜叶中金丝桃苷和异槲皮苷含量的方法意义重大。近红外光谱法(NIR)是近年来发展迅速、应用较为广泛的一种检测新技术,该方法具有分析快速、操作简便、无损、绿色等特点,被广泛应用于食品[14-15]、林产工业[16-18]、烟草[19-20]、医药[21-23]等领域。NIR 不仅可用于离线建模以实现快速检测,还可在医药、食品、烟草等工业领域实现在线实时动态快速监测,有利于产品质量的快速评价。

目前水冬瓜叶的相关研究主要集中在质量控制[4]、生药学鉴定及真伪鉴别[16]等方面,采用NIR研究水冬瓜叶的报道较少,尚未发现其在测定水冬瓜叶中金丝桃苷和异槲皮苷含量方面的应用。因此,本工作采用NIR 建立了稳定性高、预测精度较高的苗药水冬瓜叶中金丝桃苷和异槲皮苷含量快速分析模型,并应用于实际样品中金丝桃苷和异槲皮苷含量的预测,以期为贵州特色民族药水冬瓜叶的质量控制及快速检测提供方法参考,也为该药材品质的快速评价提供新思路。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Luminar 5030型声光可调滤光器近红外光谱仪,主要部件包括光学部分、控制部分、电源适配器,软件包括SNAP 光谱处理软件;The Unscrambler化学计量学分析软件;Agilent 1260型高效液相色谱(HPLC)仪,配二极管阵列检测器;PX125DZH 型电子天平;KQ3200型超声仪;WK-1000A 型高速粉碎机。

混合对照品溶液:分别取适量金丝桃苷、异槲皮苷对照品,用甲醇溶解并定容至50 mL,配制成金丝桃苷、异槲皮苷质量浓度分别为0.041 0,0.052 0 g·L－1的混合对照品溶液。

金丝桃苷对照品批号为111521-201809,纯度为94.9%;异槲皮苷对照品批号为CHB180628,纯度不小于98%。

乙腈为色谱纯;其他所用试剂均为分析纯;试验用水为娃哈哈纯净水。

水冬瓜叶药材(S1～S106),均采自于贵州省都匀市经济开发区大坪镇,经度为107°38′33″E,纬度为26°13′46″N,海拔为675 m,其中S1～S90为校正集样品,S91～S106为验证集样品。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 NIR 条件

开机预热时间0.5 h;扫描次数300次;波长范围1 100～2 300 nm;波长增量2 nm;测量方式为透射;增益调节×1;样品类型为int.Ref.;数据格式为透过率;扫描方式为比率模式。

1.2.2 HPLC条件

Agela Promosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温35℃;流动相A 为0.2%(体积分数)磷酸溶液,B为乙腈;流量1.0 mL·min－1。梯度洗脱程序:0～10.0 min时,A 由87%降至81%;10.0～20.0 min时,A 由81%降至55%;20.0～22.0 min时,A 由55%降 至30%,保 持3.0 min;25.0～25.1 min时,A 由30%跳转至87%;25.1～30.0 min时,A 为87%。

1.3 试验方法

将水冬瓜叶粉碎后过4 号筛(250 μm±9.9μm),取约1.0 g样品于具塞锥形瓶中,加甲醇100 mL,称取质量。在90 ℃水浴中回流提取1 h,冷却后再次称取质量,并用甲醇补足减失量。过滤,滤液按照NIR 仪器工作条件测定。另取适量滤液过0.45μm 滤膜,滤液按HPLC 仪器工作条件测定,所得测定值即为参考值。

1.4 建模和模型评价

将1.3 节得到的金丝桃苷和异槲皮苷的NIR原始光谱图分别用SNAP 光谱处理软件中的S-G first derivative(一阶微分法)和SNV-Smoothing(标准正态变量交换法-平滑法)进行预处理。用偏最小二乘法(PLS)在1 100～2 300 nm 和1 100～1 400 nm 波段内建模,并采用三维空间分布值(Influence)和线性相关性(Correlation)统计量对照检验,剔除模型中的异常值(Outlier)。所建模型性能用相关系数(R)、校正均方根误差(RMSEC)、预测均方根误差(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)评价。

2 结果与讨论

2.1 预处理方法的选择

受光的散射、杂散光及仪器响应等影响,原始光谱中冗余信息和噪声信号干扰较大,在定量分析前,需要选择合适的方法对原始光谱进行预处理。以苗药水冬瓜叶中金丝桃苷和异槲皮苷含量为待测对象,试验考察了预处理方法分别为SNV(标准正态变量交换法)、SNV-Smoothing、Add constant(加常法)、Add constant-Smoothing(加常-平滑法)、S-G first derivative时对所建模型性能的影响,结果见表1。

表1 预处理前后模型评价结果Tab.1 Evaluation results for model before and after pretreatment

表1(续)

由表1可知:原始光谱图经预处理后,R增大,RMSEC、RMSEP、RSEP均减小,模型性能变好;当预处理方法分别为SNV-Smoothing 和S-G first derivative时,金丝桃苷模型的R较高,RMSEC、RMSEP、RSEP较小或与其他方法的接近。综合考虑,试验分别采用SNV-Smoothing 和S-G first derivative对金丝桃苷和异槲皮苷的原始光谱图进行预处理。

2.2 建模波段的选择

为进一步降低冗余信息及噪声干扰,克服近红外光谱吸收带重叠造成的影响,并提取有效信息,需要对建模波段进行筛选。试验比较了以不同波段建模时模型的性能,所得RMSEC、RMSEP、RSEP 等结果见表2。

表2 以不同波段建模时模型的评价结果Tab.2 Evaluation results for models when modeling in different wavelength zones

由表2可知:金丝桃苷模型在1 100～2 300 nm波段、异槲皮苷模型在1 100～1 400 nm 波段时,所得R较高,RMSEC、RMSEP 和RSEP 较小 或和其他波段的接近。综合考虑,试验分别选择在1 100～2 300 nm 和1 100～1 400 nm 波段建立金丝桃苷和异槲皮苷模型。

2.3 模型的建立和评价

在优化的试验条件下,以校正集样品的红外光谱数据和参考值建立金丝桃苷和异槲皮苷的模型,结果显示:金丝桃苷模型的R为0.913 6,RMSEC为0.241 4,RMSEP为0.270 5,RSEP为0.177 5;异槲皮苷模型的R为0.907 7,RMSEC 为0.079 1,RMSEP为0.020 8,RSEP为0.033 9。

为评价建模效果,按照试验方法分析16批验证集样品,所得NIR 原始光谱图经预处理分别导入金丝桃苷、异槲皮苷模型以对金丝桃苷和异槲皮苷含量进行预测,所得结果见表3。

由表3可知:金丝桃苷和异槲皮苷的预测值与参考值的相对误差分别为－2.8%～2.9%、－5.1%～5.9%,表明所建模型预测效果较好。

表3 金丝桃苷和异槲皮苷预测结果Tab.3 Prediction results of hyperin and isoquercitrin

采用The Unscrambler化学计量学分析软件分别绘制金丝桃苷和异槲皮苷的参考值与预测值的相关图,结果见图1。

由图1可知,2种目标物预测值和参考值基本一致,相关系数大于0.988 0。

图1 金丝桃苷和异槲皮苷预测值与参考值的相关图Fig.1 Correlation diagrams between predicted values and reference values of hyperin and isoquercitrin

2.4 精密度试验

按照试验方法重复分析S1样品6次,所得光谱图经预处理后代入2种目标物的NIR模型,计算金丝桃苷和异槲皮苷预测值的相对标准偏差(RSD),结果分别为2.7%,3.3%,表明方法精密度较好。

2.5 稳定性试验

按照试验方法处理S1 样品,所得滤液分别放置0,1,2,3,6,12 h,再用近红外光谱仪分析,所得光谱图经预处理后代入金丝桃苷和异槲皮苷NIR模型,计算金丝桃苷和异槲皮苷预测值的RSD,结果分别为2.9%,3.4%,表明水冬瓜叶药材样品在12 h内稳定性良好。

本工作基于金丝桃苷和异槲皮苷的NIR 光谱图建立的模型来预测水冬瓜叶中这两种物质的含量,实现了对苗药水冬瓜叶药材的快速质量评价,可为苗药水冬瓜叶药材中金丝桃苷和异槲皮苷快速定量分析提供新方法与新思路。