不同炮制方法对紫苏子中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素含量变化的影响*

史勤怡，张倩玉，刘 莉，曾 超，刘金花

（1.徐州市儿童医院，江苏 徐州 221002；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

紫苏子为紫苏Perilla frutescens (L.) Britt.的干燥成熟果实，在临床使用上多用于紫苏子的炮制品[1-2]。在临床上，生紫苏子用于肠燥便秘，而炒紫苏子缓和辛散，多用于人的咳喘[3-4]。紫苏子炒制前后药性和药理作用均有不同程度的变化，说明炒制前后其成分含量和种类有可能发生了改变。咖啡酸属于苯乙烯酸类化合物，在多种植物中存在，主要的药理作用包括调节免疫、保护心血管和降血糖等作用[5]；迷迭香酸具有抗炎、免疫抑制等药理作用[6-9]；木犀草素为黄酮类化合物，主要的药理作用有抗炎、抗菌、抗过敏等[10-11]；芹菜素也为黄酮类化合物，具有抗炎、抗肿瘤和机体免疫调节等药理作用[12-15]。目前，对紫苏子不同炮制品活性成分含量变化的研究未见报道。笔者以紫苏子不同炮制品中的4种活性成分（咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素）为测定的目标成分，采用HPLC法测定紫苏子不同炮制品化学成分含量的变化，为进一步对紫苏子不同炮制品的质量变化和药效物质基础提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1260-П高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，十万分之一]；超声清洗器（KQ3200DE型，昆山市超声仪有限公司）；分析天平[Practum224-1CN型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；高速台式离心机（TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂）；电热恒温水浴锅（HWS-26型，上海齐欣科学仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9203A型，上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.2 药材及试剂 紫苏子药材采摘于广西桂林市龙胜县，经广西中医药大学第一附属医院主任中药师曾超鉴定，紫苏子为紫苏Perilla frutescens (L.) Britt.的干燥成熟果实。紫苏子不同炮制品，在实验室自行炮制；因实验研究需要，紫苏子的炮制方法分为阴干炮制、烘干炮制（60℃）、烘干炮制（80℃）、清炒炮制和微波炮制（12 min），按照《中华人民共和国药典》（2020年版）进行相关检查，结果均符合规定。乙腈（Merck色谱纯），甲醇（分析纯，天津市进丰化工有限公司），水为超纯水。对照品信息见表1。

表1 对照品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo ODS-2 Hypersil（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，洗脱程序为梯度洗脱（见表2），咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的检测波长分别为320、330、350和340 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，色谱柱的理论塔板数按迷迭香酸峰计算应不低于3 000。4个成分都能达到较好分离，分离度R＞1.5，样品中其它成分对测定成分无干扰。按照上述条件各组分分离度良好。（见图1）

图1 紫苏子HPLC 图

表2 梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素对照品各适量，加70%甲醇使溶解，配制成每1 mL分别含咖啡酸82.75 μg、迷迭香酸1 925.28 μg、木犀草素152.24 μg、芹菜素112.68 μg的混合对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定中药紫苏子药材样品粗粉约1.0 g，放至具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL后，称其重量，然后水浴回流提取药材1 h后取出，放至室温，再次称重，如果重量减少就使用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下配制好的混合对照品溶液0.3、1.0、3.0、5.0、9.0 mL，至10 mL棕色容量瓶中，然后加入70%甲醇溶液至刻度，轻轻摇匀，即配得一系列混合对照品溶液。按照“2.1”项下的色谱条件，分别注入一系列的混合对照品溶液进高效液相色谱仪中，测定并记录对应成分的峰面积。以各成分的质量浓度（μg/mL）为横坐标，各成分的峰面积（Y）为纵坐标，绘制各成分的线性方程，即得线性回归方程和对应的相关系数（见表3）。结果表明，咖啡酸、迷迭香酸、木樨草素和芹菜素在对应成分浓度范围之内成良好的线性关系。

表3 紫苏子中各成分的线性回归方程

2.3.2 精密度试验 按照“2.1”项下的色谱条件，精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，然后分别记录各活性成分对应的峰面积，并计算混合对照品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD值。由测得的峰面积计算混合对照品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD值，即RSD值分别为0.62%、0.35%、0.94%、0.72%，均小于3.0%，表明所用液相色谱仪的精密度较好。

2.3.3 稳定性试验 取阴干炮制品紫苏子粗粉1.0 g，精密称定，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，然后分别在供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24 h，按照“2.1”项下色谱条件分别依法测定对应成分并记录对应成分的峰面积。结果计算得紫苏子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD值，即RSD值分别为2.08%、0.97%、1.62%、1.86%，均小于3.0%，说明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 精密称取中药紫苏子不同炮制品药材粗粉1.0 g，每种紫苏子炮制品称取6份，按照“2.2”项下的供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件测定各供试品的峰面积，计算紫苏子不同炮制品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的平均含量。结果测得阴干炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均药材含量分别为0.149 6、3.019 0、0.237 3、0.153 6 mg/g；烘干炮制品（60 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均药材含量分别为0.136 5、2.915 2、0.231 9、0.155 8 mg/g；烘干炮制品（80 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均药材含量分别为0.135 9、2.811 2、0.231 5、0.156 8 mg/g；清炒炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均药材含量分别为0.115 7、2.751 9、0.241 0、0.169 6 mg/g；微波炮制品（12 min）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素平均药材含量分别为0.140 9、2.988 5、0.234 9、0.161 7 mg/g。

结果计算得阴干炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素药材含量的RSD分别为1.42%、0.91%、1.57%、0.85%；烘干炮制品（60 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素药材含量的RSD分别为0.98%、0.75%、1.08%、0.96%；烘干炮制品（80 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素药材含量的RSD分别为1.51%、1.02%、1.45%、0.90%；清炒炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素药材含量的RSD分别为1.14%、1.52%、1.08%、1.39%；微波炮制品（12 min）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素药材含量的RSD分别为1.82%、1.37%、0.98%、1.25%。其RSD值均小于3.0%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取同一批次不同炮制品紫苏子药材粗粉，即阴干炮制品、烘干炮制品（60 ℃）、烘干炮制品（80 ℃）、清炒炮制品、微波炮制品（12 min），药材粗粉各6份每份0.5 g，加入适量的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素对照品，按照“2.2.2”项下的方法制备成供试品溶液，按照“2.1”项下条件测定，根据线性方程，分别计算阴干炮制品、烘干炮制品（60 ℃）、烘干炮制品（80 ℃）、清炒炮制品和微波炮制品（12 min）紫苏子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均回收率和对应的RSD值。

结果计算得阴干炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加样回收率分别为100.31%、97.95%、101.02%、98.96%，其RSD分别为1.69%、2.45%、1.72%、2.88%；烘干炮制品（60 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加样回收率分别为99.40%、98.83%、100.14%、97.98%，其RSD分别为1.78%、2.07%、2.40%、1.56%；烘干炮制品（80 ℃）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加样回收率分别为98.62%、99.65%、98.81%、99.84%，其RSD分别为1.25%、2.32%、1.58%、1.91%；清炒炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加样回收率分别为98.72%、101.27%、99.35%、98.62%，其RSD分别为2.19%、1.87%、2.82%、1.75%；微波炮制品（12 min）中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分的平均加样回收率分别为99.83%、98.61%、102.06%、97.98%，其RSD分别为2.73%、1.80%、1.92%、2.26%。其RSD值均小于3.0%，实验结果表明该方法准确性良好。

2.4 样品含量测定 分别称取紫苏子不同炮制品药材粗粉各3份，每份1.0 g，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件测定紫苏子的4种活性成分，并采用线性方程计算紫苏子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的平均含量（mg/g），结果见表4。

表4 不同炮制品紫苏子平均含量测定结果（n＝3）

3 讨 论

3.1 流动相的选择 本实验采用HPLC法测定紫苏子不同炮制品中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素活性成分含量，考察了洗脱程序所使用的流动相，实验考察中发现流动相中加入不同种类的有机酸对4种活性成分的峰型和分离度有一定的影响。本试验采用甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%冰醋酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.2%冰醋酸等流动相进行试验考察，结果说明乙腈-0.1%磷酸作为流动相梯度洗脱，紫苏子中的咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的峰型和分离效果较好，目标成分与杂峰达到基线分离。因此可以推测本实验方法快速稳定、简便、重复性好等，可用于中药紫苏子药材的提取、工艺优化及其药材质量标准等相关研究。

3.2 波长的选择 中药方剂成分复杂，本实验采用HPLC法测定5种不同炮制品的紫苏子中的4种活性成分的含量，通过前期预试验，试验考察了流动相、柱温、流速等外部因素，从实验结果中选择峰型较好，基线较平稳，分离度较好的实验色谱条件。对于本试验目标成分波长的选择，是考虑到中药紫苏子中4个活性成分的最佳紫外吸收，使被测的活性成分都有较好的紫外吸收，通过试验比较后发现，中药紫苏子中的活性成分咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素分别在320 nm、330 nm、350 nm和340 nm波长下有较好的紫外吸收，因此试验选择波长切换法测定不同炮制品紫苏子中4种活性成分的含量，此试验方法操作简单、测定速度快、仪器灵敏度高，对中药紫苏子药材的质量控制有一定的参考价值，对于其它中药材的质量分析控制也有一定的指导作用。

3.3 柱温、流速的选择 本实验通过考察4种不同柱温20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃对分离度、出峰时间及基线的影响，经过分析色谱峰可知，柱温影响较小，因此本试验柱温采用30 ℃；同时研究者还考察3种不同的流速0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min对分离度和基线的影响，色谱图直观显示当流速为1.0 mL/min时，其分离度较好，基线也较平衡，故本试验采用的流速为1.0 mL/min。

3.4 结果分析 根据含量测定结果可知，5种不同干燥及炮制方法制备的紫苏子样品中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素、芹菜素的含量分别为0.116 0～0.150 6 mg/g、2.752 6～3.032 5 mg/g、0.221 9～0.240 5 mg/g、0.153 2～0.170 2mg/g，其中阴干炮制品样品中咖啡酸、迷迭香酸含量最高，分别为0.150 6 mg/g、3.032 5 mg/g，清炒炮制品样品中木犀草素、芹菜素含量最高，分别为0.2405mg/g、0.170 2 mg/g。5种不同干燥及炮制方法制备的紫苏子样品中4种成分的含量具有一定的差异，这可能与药材的炮制方法或者干燥方法有关，有待进一步研究。综上，本研究建立的5种不同干燥及炮制方法制备的紫苏子样品中4个成分的含量测定方法稳定可靠，可为其质量控制提供参考，也为其中药药效物质基础研究提供借鉴。

3.5 小结 本实验建立了高效液相色谱法测定紫苏子不同炮制品中的4种活性成分咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素含量的方法，可用于比较不同炮制品有效成分的含量差异，该方法为阐明紫苏子不同炮制品的药理作用机制的研究提供科学依据，为提高中药材质量标准提供指导，可作为紫苏子及其不同炮制品的质量控制方法，以及扩大到其它中药材及其炮制品的质量标准。