酚酸/淀粉复合膜的制备及抑菌性能研究

◎ 徐 平，郦丹妮，余文怡，胡佩佩，覃寒珍，余作龙，魏云潇

（浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015）

食品包装材料与食品保存、食品安全等关系密切，如何使食品包装材料安全、环保成为研究热点，尤其是近年对可食性包装膜研究较多[1-2]。可食性包装膜分为蛋白质类、多糖类、脂类以及它们的复合成膜[3-5]，加入天然多功能活性成分取代人工合成及传统的单功能食品添加剂已成为新亮点[6-7]。其中淀粉基可食膜是以淀粉为基质，以多元醇（如甘油、山梨醇、聚乙二醇等）及类脂物质（如脂肪酸、单甘油脂、表面活性剂等）为增塑剂，动植物胶（如褐藻胶、琼脂等）为增强剂制作而成[8-10]。酚酸广泛分布于自然界、种类繁多、可食用，其抗氧化、抗肿瘤、抑菌等活性功能已得到普遍认可[11-13]。本文以淀粉基可食性膜为研究对象，筛选苯甲酸型酚酸（水杨酸、龙胆酸、没食子酸）和肉桂酸型酚酸（对香豆酸、绿原酸）（结构式如图1所示）为抑菌剂，制备成抑菌性可食膜，对抑菌剂的抑制性和复合膜的性能进行研究。进而为酚酸类抑菌膜在功能性包装膜的应用领域提供参考。

图1 5种抑菌剂的结构式图

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淀粉（烟台东方蛋白科技有限公司（维德力））；海藻酸钠（山东精协海洋科技发展有限公司）；甘油（浙江杭州双林化工试剂厂）；水杨酸、龙胆酸、没食子酸、对香豆酸、绿原酸（上海阿拉丁试剂有限公司）；大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和酵母菌（Yeast），均由浙江树人大学生物与环境工程学院微生物实验室提供；肉汤培养基、Luria-Bertani培养基（LB培养基）和酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD培养基），按要求自行配制；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 试验设备

TA.XT plus物性仪（英国Stable Micro System公司）；HZQ-X300C恒温振荡培养箱（上海一恒科技有限公司）；PHS-2F精密pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；YJ-VS-1单人垂直超净工作台（无锡一净净化设备有限公司）；GI80TR高压蒸汽灭菌锅（美国ZEALWAY（致微）有限公司）；KQ-500DE数控超声波清洗（昆山市超声仪器有限公司）；JHS-2/90恒速数显搅拌机（杭州仪表电机有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 MIC测定

采用平板打孔法[14-16]。将配制好的5种抑菌剂溶液分别加入到含有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的含菌平板中，将平板放入恒温培养箱中培养，观察实验结果。大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的培养温度为37 ℃，酵母菌培养温度为30 ℃，培养时间为24～48 h。同时做空白对照。

1.3.2 抑菌膜的制备

参考文献[17]方法，100 mL水溶液中添加11 g豌豆淀粉、1.2 mL甘油、0.4 g海藻酸钠，在95 ℃下，300 r·min-1搅拌30 min，待淀粉糊化后，按照抑菌剂的MIC加入10倍～20倍量酚酸（按淀粉质量比计）考察抑菌性；加入10%抑菌剂（按淀粉质量比计）考察不同抑菌膜的力学性能。搅拌10 min，经真空脱气后，流延铺膜于钢板上，并在50 ℃烘干，揭膜，储存待用。

1.3.3 膜的抑菌性

分别配制蛋白胨培养基、LB培养基、YPD培养基等3种固体培养基，等待平板冷却后用移液枪分别移取100 μL各菌悬液于对应的培养基上，涂布均匀。将淀粉膜和不同浓度的酚酸/淀粉抑菌膜打成3 mm小圆片，分别将膜片放置于涂有菌液的平板上。倒置培养24～48 h，通过观察平板上抑菌圈的大小，衡量膜的抑菌性[18]。

1.3.4 膜的力学性能

选择平整、均匀、无孔洞、无皱褶的膜，用螺旋测微器（精度0.01 mm）测样品的4个顶点和中心点上的厚度，取5个值的平均值，即为膜的厚度，单位为mm[19]。参照GB/T 1040.3—2006[20]，将样品裁成长10 cm，宽0.5 cm的长条，用物性仪测定膜的拉伸强度（TS）和断裂延伸率（E），每组各测3个垂直与水平样品，共6个平行样品，并根据式（1）、式（2）计算平均TS与E。标距为50 mm，试样速度为100 mm·min-1。

式中：TS-抗拉强度（MPa）；F-膜所受拉力（N）；S-膜的横截面积（m2）。

式中：E-断裂延伸率（%）；L0-试样原始标准距离（mm）；L-试样断裂时标准距离（mm）。

1.3.5 红外光谱分析

裁剪一小片制得的可食膜样品，在Tensor 27型红外光谱仪进行红外光谱扫描，检测膜组分对膜结构的影响。

2 结果与分析

2.1 MIC分析

5种抑菌剂的MIC表现出不同的抑菌特性，结果如图2、表1所示，其中水杨酸的抑菌能力最好，而龙胆酸的抑菌性较差，甚至对酵母菌没有抑制性。水杨酸对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的MIC分别为9.375 mg·mL-1、15.625 mg·mL-1和9.375 mg·mL-1，而抑制性最差的龙胆酸分别为143.75 mg·mL-1、193.75 mg·mL-1和没有抑制性。

表1 5种抑菌剂的MIC表（单位：mg·mL-1）

图2 5种抑菌剂的MIC图

SÁNCHEZ-MALDONADO等[21]从构效关系的角度研究12种酚酸的抗菌活性，发现相同取代基的肉桂酸型酚酸抗菌能力优于苯甲酸型酚酸，且羟基数目越多，苯甲酸型酚酸抗菌效力越弱，而对肉桂酸型酚酸影响不大；氧甲基团取代后，苯甲酸型酚酸抗菌作用增强，而肉桂酸型酚酸的抑菌能力无显著性变化；亲油性对苯甲酸型酚酸抗菌活性的影响大于对肉桂酸型酚酸。本实验中相同羟基的水杨酸抑菌性大于对香豆酸，而含两个羟基龙胆酸抑菌性低于含3个羟基的没食子酸。因此酚酸的两亲性和所在的培养体系对抑菌剂的抑菌效果影响不可忽视[22-23]。

由于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌分别代表革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌，因其细胞壁的厚薄程度、结构复杂性和与细胞膜的关系导致同一种抑菌剂的MIC不一，同时，不同抑菌剂的MIC没有一致性。

2.2 膜的抑菌性分析

不同抑菌膜的抑菌性如图3和表2所示，当抑菌剂加入到淀粉膜中，其抑菌性降低明显，如水杨酸和对香豆酸；或没有抑菌性，如没食子酸、绿原酸和龙胆酸。水杨酸/淀粉膜对酵母菌的抑制性较为明显，MIC由水杨酸的MIC 9.375 mg·mL-1增加到水杨酸抑菌膜的MIC 117.125 mg·g-1；而对香豆酸加入淀粉膜中的MIC增幅最小。主要原因是制膜为水溶液，对浓度较高、油溶性的抑菌剂在膜液中分散影响较大，同时成膜后固体膜影响抑菌剂在培养基上扩散效果。过高浓度的没食子酸、绿原酸和龙胆酸无法成膜，所以其膜的抑菌性实验无法开展。

表2 不同抑菌膜的MIC表（单位：mg·g-1）

图3 不同抑菌膜的MIC图

2.3 膜的力学性能分析

不同抑菌剂对淀粉膜的力学性能如图4所示，抑菌剂降低了淀粉膜的拉伸强度，而对淀粉膜的断裂延伸率影响不一。从图3中不同膜的图片可知，膜的均一性和表面光滑程度随着抑菌剂的比例和种类而变化，其中对香豆酸/淀粉膜内出现肉眼可见的细小颗粒，进而表明对香豆酸对淀粉膜的拉伸强度改变最大，由15.33 MPa降低到4.28 MPa，由于小分子的抑菌剂加入起到增塑作用，降低了膜的强度；而相对淀粉膜的断裂延伸率为62.67%，抑菌剂绿原酸具有与淀粉单元相似的结构和柔性成分，使膜的断裂延伸率略微提高到67.45%。

图4 淀粉膜和不同抑菌膜的力学性能图

2.4 红外光谱分析

对抑菌剂和其抑菌膜的FTIR分析如图5和图6所示。在3 400～3 200 cm-1波长处的吸收峰均是各物质分子内或分子间的O-H伸缩振动峰；过强的羟基峰导致无法观察到C-H伸缩振动峰。在1 750～1 650 cm-1波长处为各物质的C=O伸缩振动峰；在1 520 cm-1、1 450 cm-1、1 380 cm-1和780 cm-1波长处为芳香环骨架的振动吸收峰；在约12 00 cm-1波长处为O-H的弯曲振动吸收峰[24-25]。当抑菌剂加入淀粉膜后，O-H伸缩振动峰更加强烈，C=O伸缩振动峰有所减弱，但发生了红移，说明有新的氢键生成，同时也可能导致抑菌效果的变化。

图5 5种抑菌剂的FTIR图

图6 淀粉膜和不同抑菌膜的FTIR图

3 结论

本文通过对两个种类的5种酚酸对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的MIC、加入到淀粉膜中对3种菌的MIC以膜性能进行考察。结果表明，结构相似的5种酚酸对3种菌的抑制性差异较大，其中水杨酸的抑菌性最佳，龙胆酸的抑菌性最差，甚至对酵母菌没有抑制性；当加入到淀粉膜中抑菌性均有不同程度的下降，其中，没食子酸、绿原酸和龙胆酸表现出没有抑菌性；抑菌剂的加入对淀粉膜的断裂延伸率影响不大，而对膜的拉伸强度影响较大，通过FTIR分析，分子间的作用力起到一定作用。