两株产红色素细菌的分离、鉴定及培养条件初步研究

◎ 徐姗娜，卢 军，侯鸿飞，赵芸卉

（汉中市食品药品监督检验检测中心，陕西 汉中 723000）

食品在制作过程中，经常会使用食用色素这一食品添加剂，以满足食品的感官要求。而食用色素又分为人工合成色素和天然色素。由于大多数人工合成色素被发现对人体有害，而天然色素不仅安全性高，还具有一定的药用价值和保健功能，在食品、化妆品、保健品等行业领域具有巨大的的开发价值和应用前景。目前，世界各国尤其是发达国家都在加强对人工合成色素的使用进行规范和限制，并加大对天然色素的开发、研究和利用[1]。而我国由于对天然色素的研发起步较晚，还没有达到发达国家以天然色素使用为主、人工合成色素使用为辅的程度。

食品用天然色素根据来源可分为植物色素、动物色素和微生物色素。目前，从动、植物色素中已研发出的种类较多，但价格昂贵。微生物色素多数是细菌、放线菌等的次级代谢产物，而微生物又具有易培养、生长繁殖快的特点，使得较低成本的工业生产获得此类色素成为可能。当前，已知的色素产生菌主要有假单胞菌属、微球菌属、红曲霉和沙雷氏菌属[2]等。而粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）正是重要的天然红色素——灵菌红素(Prodigiosin，PG)的主要生产菌株。

近日，本实验室在对两批次食物样品进行大肠菌群计数时，在结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）平板上发现若干颜色鲜红的菌落，这与在VRBA上呈紫红色菌落，且周围有红色胆盐沉淀环的大肠菌群明显不同。挑取可疑菌落进行划线分离，得到的菌株分别编号为WSW801和WSW851，使用全自动微生物鉴定系统进行菌种鉴定。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

菌株WSW801、菌株WSW851。

1.2 培养基与试剂

营养琼脂（NA）培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）培养基，革兰氏染色试剂为北京陆桥技术股份有限公司产品。

1.3 仪器

光学显微镜Ci-L（尼康仪器有限公司）、全自动微生物鉴定系统WalkAway-40 plus（贝克曼库尔特商贸有限公司）。

1.4 菌株鉴定方法

对菌株WSW801和菌株WSW851分别进行革兰氏染色镜检，结果显示二者皆为革兰氏阴性菌。采用Prompt快速接种法，菌株WSW801和菌株WSW851分别使用贝克曼专用取菌针沾取菌落3次，用环状盖帽将针边缘多余的细菌刮掉，将取菌针插入专用的30 mL Prompt接种水瓶中，彻底混匀。依次接种于革兰氏阴性菌鉴定板Neg Combo 50中，贴标签，放板，开始培养、鉴定，探究不同条件下WSW801和WSW851中灵菌红素的产生情况。

2 结果与分析

为研究不同培养温度对WSW801和WSW851中灵菌红素产生的影响，选用NA琼脂和VRBA琼脂两种培养基，将菌株WSW801和WSW851分别在28 ℃、36 ℃和42 ℃温度下培养24～48 h，在24 h和48 h观察灵菌红素产生的情况，结果见表1。在NA琼脂培养基上，两种菌株在不同温度条件下培养24 h后色素的产生情况见图1、图2。

图1 菌株WSW801在不同温度下培养24 h后色素产生情况图

图2 菌株WSW851在不同温度下培养24 h后色素产生情况图

表1 不同培养温度、培养基、培养时间对灵菌红素产生的影响表

结果表明，菌株WSW801和菌株WSW851经鉴定均为粘质沙雷氏菌。测定不同培养温度、培养基、培养时间对WSW801和WSW851中灵菌红素产生的影响，发现二者均能在28 ℃和36 ℃培养时产生灵菌红素，且28 ℃培养时产色素更多，而在42 ℃培养时均不产生灵菌红素；相同温度、相同时间培养时NA琼脂上的色素产量比VRBA琼脂更多；培养时间从24 h延长至48 h时，灵菌红素产生量并无明显变化。

3 讨论

粘质沙雷氏菌在自然界分布较广，可存在于土壤、水，植物和动物等的肠道和呼吸道中，属于变形菌门肠杆菌科下的沙雷菌属，革兰氏阴性兼性厌氧菌，短杆菌可近球形，无荚膜，形态上比其他肠道菌小，为细菌中最小者。沙雷氏菌所产红色素是研究较多的一类微生物天然红色素，称为灵菌红素。灵菌红素作为粘质沙雷氏菌的次级代谢产物，是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然红色素，相较于营养性低、有毒副作用的人工合成色素具有色调自然、使用安全等特点和优势，有研究发现，灵菌红素可能具有抗真菌、抗细菌等作用，因此，研究其在食品、功能性保健食品等色素添加剂工业中的应用具有较大的前景和价值[2]。

微生物相较动、植物虽然生长旺、繁殖快、易培养、适应性强，但通过微生物生产色素的条件却较为复杂，不同的碳源、氮源选择、培养温度和pH等条件对不同菌株产色素的成分及产量会有不同的影响，另外，培养基中的磷酸盐、金属离子、溶解氧等也会或多或少对次级代谢产物产生影响。粘质沙雷氏菌对生存温度的要求范围较为宽泛，但灵菌红素的合成对温度的要求却较为严格[3]，此外，不同光照、氮源[4]、培养pH[5]对灵菌红素的合成都会产生一定的影响。

本次试验结果显示，粘质沙雷氏菌WSW801和WSW851在28 ℃和36 ℃培养时均能产生灵菌红素，且28 ℃培养时产色素更多，而在42 ℃培养时不产生灵菌红素，与前人研究认为的粘质沙雷氏菌产色素最适温度范围为25～35 ℃相吻合[6]。不同培养基、培养时间对WSW801和WSW851中灵菌红素产生的影响结果显示，选用营养琼脂培养基更有利于该菌产生灵菌红素，而时间24 h对于该菌产生色素已经足够，不需再延长至48 h。

4 结论

天然色素虽具有多方面的优势，但作为次级代谢产物，本身大多是分子结构比较复杂的化合物，稳定性较差，如pH、光照、氧化剂、储存温度和食品中其他添加剂等都有可能影响天然色素的稳定性，使其发生颜色变化、褪色甚至色素损失。综上所述，为微生物生产天然色素选择最优的培养条件，使得天然色素更高产，探索天然色素的最佳贮存条件，提高天然色素的稳定性，是利用研究、开发天然色素在食品、保健食品、化妆品工业等领域的使用亟待解决的两大问题。