超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定保健食品中的缓泻剂

◎ 邓 颖，林森煜，何敏恒，杜伟锋，张瑞瑞，区硕俊

（1.广州检验检测认证集团有限公司，国家加工食品质量检验中心（广东），广东 广州 511447；2.广州海关技术中心，广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 510623）

吡沙可啶、脱乙酰吡沙可啶和双醋酚丁是一类临床上使用较广泛的缓泻剂，可用于患者结肠镜检查的肠道准备[1-2]。有研究表示，吡沙可啶与镁盐、维生素C和西甲硅油等联合使用，可提高患者的耐受性，得到较好的肠道准备质量[3-6]。尽管低剂量的吡沙可啶对肠道准备是安全有效的[7]，但也有研究表明，大剂量的吡沙可啶可诱发缺血性结肠炎[8]。目前，监管体系和相关的法律法规仍未完善，因此，此类缓泻剂可能会被不良商家违法添加至保健食品中，危害消费者的健康安全。

目前，已经报道的缓泻剂测定方法主要集中于高效液相色谱法[9-11]和高效液相色谱串联质谱法[12-16]，近年也有报道表面增强拉曼光谱技术的测定方法[17]，高效液相色谱法在实验室中较为常用，但多目标物的测定需要对每种物质进行基线分离，且容易受杂质峰的干扰。而表面增强拉曼光谱技术，虽然灵敏度要高于高效液相色谱法，但操作较为烦琐，而且对于含量较低的样品，难以检出。高效液相色谱-串联质谱法则可以在短时间内实现高通量的检测，且灵敏度高，对目标物选择性高。本文建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对保健食品中的3种缓泻剂进行测定。相比于一般的高效液相色谱-串联质谱法，能测定精确分子量，减少假阳性的情况，更加高效准确地对样品进行检测，为相关的分析方法开发提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

吡沙可啶、脱乙酰吡沙可啶和双醋酚丁（纯度大于97.5%，天津阿尔塔公司）；甲酸、乙腈、甲醇（HPLC级，美国Thermo Fisher公司）；无水硫酸镁、氯化钠（CNW，分析纯，上海安谱公司）；C18固相萃取柱、PSA固相萃取柱和HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，CNW，分析纯，上海安谱公司）；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

AB Triple TOF5600+质谱仪（美国AB SCIEX公司）；岛津LC-30AD液相色谱系统（日本岛津公司）；Milli-Q Advantage A10超 纯 水 系 统（法 国Merck Millipore公司）；4k-15离心机（德国Sigma公司）；KQ-800DB超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；MS3涡旋振荡器（德国IKA公司）；Heidolph Promax 2020摇床（德国Heidolph公司）。

1.3 实验条件

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液：分别准确称吡沙可啶、脱乙酰吡沙可啶和双醋酚丁标准品于容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为1 000 mg·L-1的标准储备液，于-4 ℃保存。

标准中间液：准确移取100 µL标准储备液于10 mL容量瓶中，再用乙腈稀释至刻度，得到10 mg·L-1的标准中间液。

标准曲线：用乙腈液稀释标准中间液，得到各级浓度为2.0 µg·L-1、5.0 µg·L-1、10.0 µg·L-1、20.0 µg·L-1、50.0 µg·L-1、100.0 µg·L-1和200.0 µg·L-1曲线。

1.3.2 前处理方法

减肥茶、片剂样品直接粉碎，胶囊样品取出内容物混合均匀，待测。

称取1.0 g上述样品于50 mL离心管中，加入10 mL水，使样品涡旋分散，再加入10 mL乙腈，涡旋混匀，加入3.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠，水平振摇15 min。然后置于离心机中以10 000 r·min-1离心5 min。

转移1 mL上清液于试管中，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 50%甲醇水溶液，涡旋2 min，待固相萃取净化。将C18固相萃取小柱依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，将待净化的样品加入小柱，3 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱，减压抽干小柱，最后用5 mL甲醇洗脱，洗脱液40 ℃氮吹至近干，1 mL乙腈定容，取上清液过0.22 μm有机滤膜上机。

1.3.3 色谱条件

色 谱 柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）；进样量为5.0 μL；柱温为40 ℃；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；洗脱模式：等度洗脱，A∶B=70∶30。

1.3.4 质谱条件

离子源：ESI和APCI复合源，正离子扫描；一级TOF-MS扫描质量范围（m/z）：50～1 000 Da；二级IDA-MS扫描准确质量范围（m/z）：50～1 000 Da。每10个样品自动校正1次，正离子模式校正液流速为0.5 mL·min-1，气帘气（N2）：40 psi，离子源雾化气（N2）：50 psi，离子源加热辅助气（N2）：50 psi，离子源温度为550 ℃，离子源电压5 500 V。去簇电压DP为90 V，碰撞能量CE为（30±15）eV；监测模式：TOF-IDA-MS。

1.3.5 数据分析处理

使用AB SCIEX公司的Analyst TF 1.6软件采集化合物的母离子和碎片信息，PeakView 2.0和MasterView 2.0软件定性处理，MultiQuant 3.0软件定量处理。通过TOF-MS和IDA-MS过滤得到响应值超过500 cps的母离子及响应值超过5 000 cps的分子离子所产生碎片的精确分子量。以母离子的精确分子质量及其同位素丰度比、二级碎片的精确分子质量及丰度比和色谱保留时间等信息作为定性依据，以母离子响应强度进行定量。对保健食品中的3种缓泻剂进行定性定量分析。吡沙可啶、脱乙酰吡沙可啶和双醋酚丁的质谱参数见表1，标准品提取离子流图见图1。

表1 吡沙可啶、脱乙酰吡沙可啶和双醋酚丁的碎片参数表

图1 标准品提取离子流图

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

实验前期对提取剂进行了初步的筛选，分别使用乙腈和甲醇对样品进行提取，比较了各自的回收率。结果显示，乙腈和甲醇回收率相当，均在85%～100%。但是使用乙腈提取，可通过盐析分层去除水溶性杂质，对仪器和色谱柱有一定的保护作用，同时也可以减少杂质在质谱中对目标物离子化的影响，降低基质效应。乙腈和甲醇的回收率见图2。

图2 不同溶剂对回收率的影响图

2.2 提取方式的选择

实验对比了摇床、超声和涡旋振荡3种提取方式，在同样提取15 min的情况下，涡旋振荡和摇床的提取方式效率最高，回收率均在85%以上。超声回收率只有60%～70%。其原因可能是超声过程中，样品和溶液的接触部分少，溶液整体浓度不均匀所导致的，同时加入无水硫酸镁和氯化钠之后，由于体系中离子强度加大，导致乙腈和水之间的氢键断裂，从而分层，进一步导致样品提取不均匀，最终回收率较低。同时，考虑到日常的批量处理，最终选择摇床作为提取方式。

2.3 固相萃取柱的选择

由于直接提取的方式会令提取液中含有较多的杂质，影响分析结果。因此实验采用固相萃取的净化方式对提取液进行净化。实验选择了HLB、PSA和C18固相萃取柱进行净化，以3种目标物的回收率为评判依据，选择回收率最高的固相萃取柱。结果显示，HLB、PSA和C18固相萃取柱对吡沙可啶、脱乙酰吡沙可啶和双醋酚丁的回收率差别不大，回收率最高的为C18固相萃取柱。在4 mL洗脱液的条件下，基本回收率在85%以上，稳妥起见用5 mL洗脱。详细结果见图3。

图3 不同固相萃取柱对回收率的影响图

2.4 质谱条件优化

为得到响应较高且较稳定的母离子，分别对3种缓泻剂的ESI正负模式进行扫描测定。结果显示，3种缓泻剂在ESI负模式的条件下，响应远低于正模式。因此选择正模式进行测定，同时对不同离子加合后的母离子响应做了对比。由于3种化合物均含有N原子，因此在+H的情况下，母离子响应均较高。各离子化模式峰面积见表2。

表2 不同离子化模式下的母离子峰面积表

2.5 线性关系和检出限

将配制好的标准系列曲线，按照1.3.3和1.3.4的仪器条件进行测定。测定后分别以浓度（μg·L-1）为横坐标，峰面积（cps）为纵坐标进行一次方程拟合，得到3种目标物的线性方程，相关系数均大于0.998 9，说明线性关系良好。另外，进行低浓度水平的加标实验，以3倍和10倍信噪比确定方法检出限和定量限。其中3种目标物的检出限为7.0～20 μg·kg-1，定量限为20～50 μg·kg-1，满足一般样品的含量测定要求，结果见表3。

表3 线性方程、检出限和定量限表

2.6 回收率与精密度实验

为验证优化后的方法的回收率和相对标对偏差是否符合检测的标准，对3种缓泻剂呈阴性的减肥茶进行加标回收实验，实验分别对3种缓泻剂定量限的不同倍数进行标准添加，平均回收率在84.6%～95.3%。每个水平处理6个平行样品，并在同一日内进行测定，根据回收率结果，计算出6个平行样品的相对标准偏差（RSD），结果在3.63%～6.22%，说明方法整体精密度较高，重复性好。具体结果见表4。

表4 不同水平的加标回收率和相对标准偏差表（n=6）

2.7 实际样品的测定

使用建立的方法检测了30个市售样品，其中包括15个减肥茶和15个压片糖果，结果为：一个压片糖果检出双醋酚丁，含量为0.21 mg·kg-1。

3 结论

本文使用了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱对保健食品中的吡沙可啶、脱乙酰吡沙可啶和双醋酚丁3种缓泻剂进行测定，以C18固相萃取柱对提取液进行净化，效果较好；在优化的色谱条件下，3种缓泻剂在3 min内完成出峰，峰型良好；结合高分辨质谱，测定目标物碎片的精确分子量，减少了假阳性的可能；通过对不同离子加合得到的母离子进行测定，选择了响应最优的母离子；方法学验证结果显示，方法回收率好，重现性高，线性方程和检出限、定量限均可满足测定的要求。