高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉中乳铁蛋白含量

◎ 郑仕剑，徐腾洋，焦玉芬，盛华栋

（浙江方圆检测集团股份有限公司，浙江 杭州 310018）

乳铁蛋白是一种天然的、具有免疫功能的球状单体糖蛋白，属于转铁蛋白家族的一员[1]。1939年Sorensen等在动物乳中发现[2]；1959年Groves用色谱制得纯品；1960年Montreuij&Johansonb在人乳中发现，1961年Blanc和Isliker从人乳中分离获得并正式命名为乳铁蛋白[3]。乳铁蛋白具有杀菌和抑菌[4-5]、抗病毒[6]、抗氧化、免疫调节、调整肠道菌群、促进铁吸收等功能[7-9]，是一种新兴的功能性食品营养强化剂，常用于婴幼儿配方食品中。研究表明，人及牛的初乳中乳铁蛋白含量较高，人乳中乳铁蛋白含量约占总蛋白含量的22%，而牛乳中不到1%，人乳中乳铁蛋白含量远高于牛乳中[10]。随着经济的发展，人们对食品营养要求越来越高，特别是婴幼儿食品，通过向其添加分离纯化的牛初乳乳铁蛋白，使婴幼儿配方食品趋向于母乳化。近年来乳铁蛋白成为了一个热点，为了更好地研究乳铁蛋白及其功能，需要建立有效的检测方法。

目前，《食品安全国家标准食品营养强化剂乳铁蛋白》（GB 1903.17—2016）中简单介绍了食品营养强化剂-乳铁蛋白占总蛋白含量的检测方法[11]，《奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法》（T/TDSTIA 006—2019）[12]中介绍了液相色谱法测定奶与奶制品中乳铁蛋白的含量，但国内尚未制定婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白含量测定的国家标准检测方法，乳铁蛋白未进入检测体系，每年的食品安全监督抽检并未包含该项检测，婴幼儿配方乳粉中常常添加一定量乳铁蛋白，国外婴儿配方乳粉中乳铁蛋白的添加量在50 mg/100 g左右[13]，按照《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》（GB l4880—2012）规定，婴幼儿配方食品中乳铁蛋白最大允许添加量为100 mg/100 g[14]。

检测方法的匮乏，会影响业界对婴幼儿配方乳粉质量的判定，不利于婴幼儿配方乳粉中营养强化添加剂的风险监督监测，因此，急需对婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白的检测方法进行探究，完善我国食品安全管控体系。乳铁蛋白的测定方法主要有分光光度法[15]、酶联免疫吸附法[16-17]、毛细管电泳法[18]、高效液相色谱法[19-20]和高效液相色谱串联质谱法[21]等。分光光度法测定乳铁蛋白含量时的准确性较差，酶联免疫吸附法和高效毛细管电泳法的样品前处理操作比较烦琐，预处理时间也较长[22]。相对而言，色谱法的测定准确性好，肝素免疫亲和柱处理后目标峰明确，干扰峰少，且具有前处理简单、用时短等优点。

婴幼儿配方乳粉成分复杂，有脂肪、碳水化合物、蛋白质含量高，其中乳铁蛋白含量低，各种杂蛋白干扰大，且单一仪器往往难以满足检测需求，多仪器联用是乳铁蛋白检测方法建立的研究方向。建立婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白含量测定相应的检测方法，并对不同主流品牌婴幼儿配方乳粉进行筛查，为婴幼儿配方乳粉中乳铁蛋白含量分析提供基础参考数据，为国家出台相关检测方法及添加限量要求提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂

乳铁蛋白标准品，北京美正生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），美国默克公司；氯化钠、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，三氟乙酸（均为分析级），上海凌峰化学试剂有限公司。

1.2 仪器

岛津LC-20AD高效液相色谱仪（日本，岛津公司），配备二极管阵列检测器（DAD）；Milli-Q超纯水系统（美国，Millipore），HiTrapTMHeparin HP（1mL）肝素亲和柱（美国通用电气医疗集团）；高速离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；超声仪（上海生析超声仪器有限公司）。

1.3 溶液的配制

（1）磷酸缓冲盐A（0.1 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4缓冲盐）。称取磷酸二氢钠1.92 g，磷酸氢二钠11.93 g，加适量水溶解，定容至1 L。

（2）磷酸缓冲盐B（0.1 mol·L-1NaCl，0.05 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4缓冲盐）。称取磷酸二氢钠0.96 g，磷酸氢二钠5.96 g，氯化钠5.84 g，加适量水溶解，定容至1 L。

（3）磷酸缓冲盐C（1.0 mol·L-1NaCl，0.05 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4缓冲盐）。称取磷酸二氢钠0.96 g，磷酸氢二钠5.96 g，氯化钠58.4 g，加适量水溶解，定容至1 L。

1.4 标准溶液的配制

1.4.1 标准储备液的配制

乳铁蛋白标准储备液（10 mg·mL-1）：称量按证书提供的纯度（99%）换算后的质量0.101 0 g，用水定容至10 mL，于-20 ℃保存。

1.4.2 标准中间溶液的配制

乳铁蛋白标准中间溶液（1.0 mg·mL-1）：准确移取乳铁蛋白标准储备液500μL，用磷酸缓冲盐A定容至5 mL。

1.4.3 标准工作溶液的配制

乳铁蛋白系列标准工作溶液：准确移取一定量乳铁蛋白标准中间溶液，用磷酸缓冲盐A稀释定容，配制成0.01 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1和1.00 mg·mL-1系列标准工作液。

1.5 样品处理方法

称取5.0 g样品于50 mL离心管中，加入30 mL磷酸盐缓冲液A，涡旋振荡至全部溶解，再用磷酸调节pH至4.5，沉淀酪蛋白，混匀，10 000 r·min-1离心10 min，上清液转移至50 mL容量瓶中，磷酸盐缓冲液A定容至刻度，混匀，过水系滤膜，取中间滤液于2 mL进样瓶中待HPLC检测。

1.6 HPLC色谱条件

色谱柱：HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素亲和柱；柱温：35 ℃；进样量：100 μL；检测波长：280 nm；流速：0.5 mL·min-1；流动相梯度洗脱条件：0～3 min磷酸缓冲盐A（100%），3～7 min磷酸缓冲盐B（100%），7～22 min磷酸缓冲盐C（100%），22～30 min磷酸缓冲盐A（100%）。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 色谱柱的选择

高效液相色谱法分离婴幼儿乳粉中乳铁蛋白常用的色谱柱有大粒径C4、C8、C18等反相色谱柱，婴幼儿乳粉成分复杂，且乳铁蛋白含量低，各种杂蛋白干扰较大，以上柱子常常不能将乳铁蛋白与其他杂蛋白进行有效分离，且需要用到肝素亲和柱进行前处理净化提纯。本文提出将肝素亲和柱直接作为色谱柱，净化分离乳铁蛋白，DAD检测。肝素亲和柱是分离糖基化蛋白质的常用净化柱。肝素亲和柱中的配体主要是硫酸化糖胺聚糖，肝素由交互的糖醛酸和D-葡糖胺单位组成，且被一个或两个硫酸基团取代，肝素可作为亲和配体，和乳铁蛋白相互作用，具有高选择性。因此，选择肝素亲和柱，可以使乳铁蛋白特异性地与其结合，其他杂蛋白由于不与肝素亲和柱结合，保留时间短，流出色谱柱时间较早，与乳铁蛋白分离开。使用肝素亲和柱作为色谱柱，可以减少前处理净化过程，提高检测效率，且液相色谱自动进样，程序洗脱，稳定性好。标样谱图见图1，样品谱图见表2。

图1 乳铁蛋白溶液（0.5 mg·mL-1）高效液相色谱图

2.1.2 流动相条件的选择

在pH为5～10时，肝素亲和柱都是稳定的，选用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液作为缓冲溶液，在进样前，用5～10倍柱体积的此缓冲溶液（流动相A）平衡柱子。根据乳铁蛋白和肝素亲和柱的结合特性，肝素具有大量阴离子的硫酸基团，可以增加离子强度把乳铁蛋白从亲和柱上洗脱下来。因此在流动相B中加入少量NaCl，淋洗色谱柱，梯度洗脱，逐渐增加NaCl浓度（流动相C），最终把乳铁蛋白洗脱下来。

2.1.3 进样体积、检测波长及流速的确定

我国婴幼儿配方食品中乳铁蛋白最大允许添加量为100 mg/100 g，含量较低，因此为提高信号响应，选择进样100 μL。

使用紫外分光光度计对乳铁蛋白标准溶液进行光谱扫描，发现其在波长220 nm、280 nm处有较强的吸收，但在波长220 nm时，基线不平稳，噪声较大，而在280nm时，基线噪声较小，灵敏度高，因此选择280 nm作为检测波长。

肝素亲和柱较短，适宜流速为0.1～1.0 mL·min-1，流速太小，出峰慢，会增加分析时间，同时峰形会变宽；流速太大，目标物质还没与干扰物质分离开就被洗脱下来。在流速0.5 mL·min-1时，峰形尖锐，干扰小，因此选择0.5 mL·min-1的流速。

2.2 前处理条件的优化

婴幼儿乳粉中蛋白种类繁多，成分复杂，蛋白相互之间干扰大，且酪蛋白占80%以上，为了尽可能得到较干净的样品，采用50%甲醇法沉淀，磷酸调pH沉淀，硫酸锌沉淀法进行试验，除去乳粉中以酪蛋白为主的杂质蛋白。结果表明，甲醇沉淀和硫酸锌盐析沉淀样品，回收率在75%，回收率差，而用磷酸盐提取后，磷酸调pH至4.5，离心过膜上机，能有效除去酪蛋白，回收率达95%，见图2。

图2 两种前处理方法的回收率图

该方法操作简单，且提取液中成分与流动相中磷酸盐缓冲液基本一致，降低提取液对流动相的干扰，故选用磷酸调pH法作为前处理净化方法。

2.3 标准曲线及检出限、定量限

吸取不同浓度乳铁蛋白系列标准工作溶液100 μL，在上述色谱条件下，经HPLC测定，保留时间19.169 min，峰形尖锐，基线较平稳。

以峰面积y为纵坐标，乳铁蛋白标准溶液质量浓度x（mg·mL-1）为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，乳铁蛋白线性回归方程为y=2 546 380x-640.579，相关系数0.999 98，标准曲线图见图3，结果显示，在0.01～1.00 mg·mL-1，所得峰面积与浓度的线性关系较良好。

图3 乳铁蛋白的标准曲线图

方法学中检出限（LOD）和定量限（LOQ）由信噪比（S/N）计算得出，检出限（S/N=3）为0.1 mg/100 g，定量限（S/N=10）为0.3 mg/100 g

2.4 方法的加标回收率

在空白奶粉中添加不同浓度的乳铁蛋白，进行加标回收试验，分别进行6平行试验，加标回收率89.9%～101.0%，相对标准偏差1.61%～4.00%，结果见表1。

表1 不同浓度加标回收率结果表

2.5 精密度及重现性试验

取同一市售婴幼儿乳粉，按1.5中的方法进行样品处理，按1.6中的色谱条件进行检测，做6次平行试验，结果6次测定的平均值为44.9 mg/100 g，范围 为42.4～47.2 mg/100 g，RSD为3.85%；对 同 一市售婴幼儿乳粉，换不同操作人员，做6次重复试验，结果6次测定的平均值为45.1 mg/100 g，范围为42.9～46.9 mg/100 g，RSD为3.21%，见表2。结果表明，该方法精密度较高，重现性较好。

表2 同一奶粉6次平行实验结果和重现性测试结果表

2.6 实际样品的检测

对市场上不同品牌婴幼儿乳粉进行检测，检测结果见表3。

表3 市场上婴幼儿乳粉中乳糖蛋白的测定结果表

不同品牌的婴幼儿乳粉中乳铁蛋白的含量各不相同，营养成分表中显示添加外源性乳铁蛋白的乳粉有检出，而营养成分表中未标注添加外源性乳铁蛋白的乳粉都未检出。

3 结论

本实验采用高效液相色谱串联肝素亲和柱对婴幼儿乳粉中乳铁蛋白含量进行检出，首次提出将肝素亲和柱应用到乳铁蛋白上机分析中，优化之后，试样中的乳铁蛋白经磷酸缓冲盐A（0.1 mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4缓冲盐）提取，过膜上机，经HiTrapTMHeparin HP 1 mL规格的亲和柱分离，二极管阵列检测器检测，外标法定量。方法平均加标回收率在89.9%～101.0%，相对标准偏差（RSD）在1.61%～4.00%，定性检测限（LOD）是0.1 mg/100 g，定量检测限（LOQ）是0.3 mg/100 g。本方法与文献中报道的方法比较，具有前处理操作简单，快速，检测成本低，可大批量上机检测，重复好，灵敏度高等优势，能满足目前乳粉中乳铁蛋白含量的检测，为国家出台相关检测标准及添加限量要求提供技术支持。