冰片阿司匹林固体脂质纳米粒的制备及脑靶向分布*

付丽娜，赵 宁，李伟泽，韩文霞，李 健，余可嘉

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

脑卒中是一类严重危害人类生命健康的疾病，中国新发脑卒中患者每年高达200万，其中缺血性脑卒中约占80%[1-3]。长时间的缺氧将导致不可逆的损伤，因此溶栓疗法是临床上治疗缺血性脑卒中的有效方法，但受限于较短的时间窗3～4.5 h，超出时间窗则疗效不佳[4-6]。

阿司匹林(ASP)是应用最广泛的抗血小板凝集药物，常用于心脑血管疾病，在缺血性脑卒中的治疗中起到重要作用。此外，ASP还可以保护中老年人的脑部神经，抑制中枢神经系统的炎症反应，避免神经元的损伤，与其他药物联合可有效治疗老年痴呆病症等[7]。但是，ASP的化学性质不稳定，易水解，且透过血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)的能力低因而影响了对缺血性脑卒中以及其他脑部疾病的疗效。因此，设计开发提高ASP稳定性的脑靶向给药系统显得尤为重要。

中医理论认为芳香开窍药善于走窜，能通窍开闭、苏醒神识，因此常用于治疗心脑血管药物。冰片(BO)是常用的芳香开窍药之一，具有“芳香之性走窜”，具有引药上行之功效；现代研究表明，BO可以促进许多药物透过BBB进入脑组织[8-9]，还能促进活细胞、脂质体等透过BBB[10]。BO诱导BBB开放为生理性开放，不会引起脑的病理性损害且有一定的保护作用。固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)是一种新型纳米给药系统[11-12]，主要以固态天然脂质如卵磷脂或合成类脂如三酰甘油等为载体，将药物包裹或镶嵌于纳米粒的骨架中可提高药物的载药量和稳定性；同时，由于其基质材料的亲脂性特征与纳米尺寸的特性，SLN能够提高药物通过体内生物膜的渗透性、控制药物的释放以及实现药物靶向转运[13-14]。目前，尚未见到将ASP(或ASP与BO)制成SLN的报道，因此，实验研究探讨BO对ASP制成SLN后的性能与脑靶向分布的影响，从而为ASP脑靶向给药系统的设计提供了依据。

1 实验部分

1.1 原料、试剂与仪器

健康昆明种小鼠：批号20190505，112只[雌雄各半，体重(20±5)g]，购自西安交通大学医学部。

阿司匹林：批号20170723，华阴市锦前程药业有限公司；冰片：批号20170712，山东滨州智源生物科技有限公司；阿司匹林标准品：批号100113-201803，中国食品药品检定研究院；单硬脂酸甘油酯：西安小草植物科技责任有限公司；大豆卵磷脂：上海太伟药业有限公司；胆固醇：安徽科宝生物工程有限公司；硫酸鱼精蛋白：梯希爱化成工业发展有限公司；乙腈、甲醇：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；冰醋酸：天津市富宇精细化工有限公司；肝素钠注射液：批号20170305，常州千红生化制药。

高效液相色谱仪(HPLC)：Agilent1260，美国安捷伦科技有限公司；光子相关光谱仪(PCS)：ZEN-3600，英国马尔文公司；扫描电镜(SEM)：Verios 460，美国FEI公司；透射电镜(TEM)：JEM-2000EX，日本电子株式会社；恒温加热磁力搅拌器：B11-1，上海司乐仪器有限公司；离心机：SIGMA1-14，分析天平：Quintix224-1CN，赛多斯科学仪器公司；氮吹仪：JOYN-DCY-125，上海乔跃电子有限公司；涡旋振荡仪：QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；超声仪：KQ-5200E，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 ASP测定方法的建立

1.2.1.1 样品预处理

(1)血样。各组动物取血1 mL，n=3 000 r/min离心10 min，吸取血浆0.1 mL，加入甲醇300 μL，涡旋振荡1 min后，n=13 000 r/min离心10 min，取上清液；在40 ℃水浴下，氮气吹干，残留物用500 μL的流动相[乙腈-φ(冰醋酸)=5%水溶液(体积比为20∶80)]复溶，涡旋混匀1 min，n=13 000 r/min离心10 min，取上清液，备用。

(2)脑组织样品。取血后处死小鼠，仔细分离脑组织并称量，加入1.5倍量生理盐水，匀浆，n=3 000 r/min离心10 min，取500 μL脑匀浆液，其余操作同上。

1.2.1.2 测定方法

采用HPLC测定ASP质量浓度。色谱柱：Hyper-sil BDS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-φ(冰醋酸)=5%水溶液(体积比为20∶80)；检测波长：303 nm；进样量：20 μL；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min。

称取ASP对照品8.000 mg，精密称定后置于2 mL的棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再用乙腈分别稀释成ρ(ASP)=40、80、125、250、500、1 000 μg/mL的标准品溶液；取各标准品溶液20 μL，注入HPLC中测定，并以峰面积A为纵坐标、以质量浓度ρ为横坐标进行线性回归。

1.2.2 AB-SLN的制备及药剂学性质考察

1.2.2.1 AB-SLN的制备

采用微乳-低温固化法。称取处方量ASP与BO置于乳钵中研匀，并与0.15 g单硬脂酸甘油酯、0.3 g大豆磷脂混合，加入5 mL无水乙醇，密闭，于70 ℃水浴溶解作为油相；称取0.2 g普朗尼克F-68，加入10 mL纯化水于70 ℃水浴溶解作为水相；n=1 000 r/min，将水相缓慢加入油相，搅拌30 min，得初乳并将其分散至45 mL冷水中，搅拌固化20 min，再高速匀质5 min，过0.45 μm微孔滤膜，即得AB-SLN。同法，不加BO制备A-SLN。

1.2.2.2 AB-SLN药剂学性质

取AB-SLN样品适量，稀释后注入PCS测定脂质体微粒的粒径与Zeta电位；取AB-SLN样品适量，稀释后滴于硅晶片上，真空干燥后，在SEM下进行外观形态观察。

1.2.2.3 包封率测定

精密量取AB-SLN样品1.0 mL置于2 mL离心管，加同体积鱼精蛋白溶液(10 mg/mL)，混匀，静置3 min，t=10 ℃、n=13 000 r/min离心10 min，沉淀用φ(Triton X-100)=12%溶液消解至澄清，取20 μL进样，按照公式(1)计算包封率。

包封率=(m包封/m总)×100%

(1)

式中：m包封为被SLN包封的药量，g；m总为实际加入的总药量，g。

1.2.2.4 稳定性考察

取AB-SLN样品适量，室温条件下放置14 d，按照1.2.2.3方法测定AB-SLN的包封率，考察AB-SLN的稳定性。

1.2.3 AB-SLN的体内药动学研究

将实验动物随机分为4组，AB-SLN-1[m(BO)∶m(ASP)=1∶1]，AB-SLN-2[m(BO)∶m(ASP)=3∶1]，AB-SLN-3[m(BO)∶m(ASP)=5∶1]，A-SLN(不含BO)，每组28只(雌雄各半)，按照ASP给药剂量20 mg/kg，给予各组动物分别灌胃给药各受试样品；给药后，各组分别于0、0.25、0.5、1、2、3、4和6 h取小鼠血样及脑样，按照1.2.1.1方法处理，并测定分析，考察不同质量浓度冰片对ASP入小鼠血液及脑浆作用的影响。

2 结果与讨论

2.1 ASP测定方法的建立

2.1.1 标准曲线绘制

分别将ASP标准品溶液按照1.2.1.2方法进样测定，得标准曲线y=2.944 2x-100.76，R2=0.999 7，线性范围40～1 000 μg/mL，表明线性关系良好。

2.1.2 方法学考察

取小鼠空白及灌胃给药的血浆、脑组织样品，分别加入ρ(ASP)=250 μg/mL标准品溶液，按照1.2.1.1方法操作、1.2.1.2方法测定，色谱图见图1，表明在该色谱条件下内源性杂质不干扰ASP的测定。

图1 阿司匹林HPLC图谱

2.1.3 精密度测定

精密量取ρ(ASP)=1 000、250、40 μg/mL标准品溶液，按照1.2.1.2色谱条件每天(0、2、4、6、8和10 h)进样，测定A值，其RSD小于2.5%，表明测定方法的精密度良好。

2.1.4 稳定性考察

取小鼠空白血浆、脑组织样，分别加入ρ(ASP)=250 μg/mL标准品溶液，按照1.2.1.1方法操作，分别取10 μL上清液，按照1.2.1.2色谱条件在1 d内(1、2、4、6和12 h)进样测定A值，其RSD分别为3.82%(n=5)和2.14%(n=5)，表明测定方法的稳定性良好。

2.1.5 回收率实验

量取ASP的高、中、低3个质量浓度的对照品溶液，按照1.2.1.1方法操作，按照1.2.1.2色谱条件测定，通过对照品测得量与加入量之比计算回收率。结果血浆中样品的回收率分别为92.54%、98.20%、94.52%，其RSD为3.02%；脑组织中样品回收率分别为95.04%、94.61%、97.63%，其RSD为1.71%。

2.2 AB-SLN药剂学性质考察结果

2.2.1 粒径与Zeta电位

AB-SLN注入PCS后测定结果见图2。

d/nma 粒径

E/mVb 电位图2 AB-SLN粒径电位图

由图2可知，AB-SLN粒径为(195±12)nm，PDI为0.162，表明粒度分布均匀；表面Zeta电位为(-32±2.7)mV。有研究表明，当纳米粒的表面Zeta电位绝对值大于30 mV时，可显著提高其物理稳定性且利于粒径保持均匀[15]。

2.2.2 外观形态

通过SEM和TEM观察AB-SLN，结果见图3。

a SEM

b TEM图3 AB-SLN电镜图

由图3可知，AB-SLN在电镜下呈均匀的圆球状结构，用TEM进行形态结构观察，结果表明AB-SLN在电镜下呈均匀的圆球状结构。

2.2.3 包封率

AB-SLN对ASP的包封率测定结果为(76±5.2)%，表明AB-SLN包封率良好。

2.2.4 稳定性考察

AB-SLN在室温条件下放置14 d，包封率为0 d时的98.4%，表明AB-SLN稳定性较好，能够避免ASP的水解而提高其稳定性。

2.3 AB-SLN的体内药动学研究结果

AB-SLN的体内药动学研究结果见图4(n=4)、图5(n=4)。

t/h图4 ASP的血药浓度图

由图4可知，A-SLN组的药峰浓度(Cm)分别为AB-SLN-1、AB-SLN-2与AB-SLN-3的1.58、1.79与2.07倍，表明A-SLN递送ASP主要分布聚集在血液中；A-SLN组的药峰时间为tm=0.5 h，而加入BO后的AB-SLN-1、AB-SLN-2与AB-SLN-3的药峰时间为tm=3 h，可能是因为加入BO后促进了药物ASP先进入脑组织，从而导致ASP在血液中药峰时间延迟。

t/h图5 ASP的脑药浓度图

由图5可知，AB-SLN-1、AB-SLN-2与AB-SLN-3在脑组织中的药峰时间为tm=1 h，而A-SLN组的tm=2 h，并且AB-SLN-1、AB-SLN-2与AB-SLN-3的Cm分别为A-SLN组的1.94、2.55与2.71倍，结果表明BO能够促进药物ASP进入脑组织，AB-SLN具有确切的脑靶向作用。ASP各给药系统均在达到峰浓度Cm以后，w(脑药)缓慢降低并同比显著高于A-SLN组，表明AB-SLN比A-SLN具有更好的缓释效果，可有效延长治疗时间。

3 结 论

采用微乳-低温固化法制备的AB-SLN外观呈均匀的圆球状粒状结构，其粒径为(195±12)nm，表面Zeta电位为(-32±2.7)mV；SLN形成的骨架结构对药物具有良好的包载作用，药物BO-ASP的包封率达到(76±5.2)%，由于药物被包埋于SLN骨架结构中避免了与外界环境的接触，因而提高了药物的稳定性，AB-SLN在室温放置14 d，包封率仍为0 d时的98.4%。药动学实验证实，当加入BO后AB-SLN在脑组织中的药峰时间tm比A-SLN组提前，且在脑组织中的达峰药物浓度Cm高于A-SLN组，表明AB-SLN能够促进药物ASP进入脑组织而实现脑靶向和缓释作用。综上，AB-SLN为ASP脑部疾病的治疗提供了一种新型脑靶向给药系统，具有一定的科学意义和广阔的临床应用前景。