基于SIRT1/ROR-γt通路探讨白藜芦醇对铜绿假单胞菌诱导的免疫抑制肺炎小鼠的治疗作用*

2021-11-24罗劲松夏利平刘宏

西部医学 2021年11期

罗劲松夏利平刘宏

(武汉大学人民医院，湖北武汉 430060)

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)又称绿脓杆菌，属于假单胞菌属，是医院获得性感染和肺部感染的主要致病菌之一[1]。铜绿假单胞菌耐药性强，耐药谱广，感染后难以清除，易形成慢性感染，为临床治疗带来巨大困难。沉默信息调节蛋白1(silent information regulator protein 1，SIRT1)属于烟酰腺嘌呤二核苷酸(nicotinemide adenine dinucleotide，NAD+)依赖的类组蛋白去乙酰化酶[2]。SIRT1通过去乙酰化调节下游通路，在炎症、细胞存活等过程中发挥重要作用[3]。核孤儿受体-γt(ROR-γt)与炎症有关，当ROR-γt缺陷时，组织浸润和募集炎症细胞能力降低，炎症性疾病症状减轻[4]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是最初从藜芦花中分离得到的酚类物质，存在于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物，具有抗炎、调节免疫等多种药理学作用[5-7]。据研究，白藜芦醇可通过调节SIRT1介导的信号通路参与抗炎反应的保护因子[8]。魏晶等[9]研究发现，白藜芦醇能够促进哮喘幼鼠肺组织中SIRT1的表达，从而减轻炎症反应。但目前关于白藜芦醇对免疫抑制肺炎小鼠的治疗作用与SIRT1表达是否有关，尚未见相关报道。本研究通过建立铜绿假单胞菌诱导的免疫抑制肺炎小鼠模型，探究白藜芦醇的药效作用以及与SIRT1/RORγt通路的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 8周龄雌性BALB/c小鼠，体重25～35g，购自广州医科大学，许可证号：SYXK(粤)2020-0227，实验遵守3R原则。

1.2 主要试剂白藜芦醇(>98%，批号：ZL2017851 42144，东明格鲁斯生物科技有限公司)。环磷酰胺(CTX)(批号：18022625，江苏盛迪医药有限公司)。IL-17 ELISA试剂盒(ab100702)，SIRT1(ab54334)、ROR-γt(ab268112)、DAPDH(ab222428)一抗及二抗(货号：ab150077)购自英国Abcam公司。伊红苏木精试剂盒(货号：C0105)、蛋白提取试剂盒(货号：P0028)、BCA试剂盒(货号：P0012)购自上海碧云天公司。总RNA提取试剂盒(DP431)购自北京天根生化科技有限公司。反转录试剂盒(RR023A)、荧光定量PCR试剂盒(RR086A)购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.3 实验仪器荧光定量PCR仪和电泳仪购自美国Bio-Rad公司，转膜仪购自美国Invitrogen公司，凝胶成像仪购自杭州Miulab公司，光学显微镜购自德国Leica公司。

1.4 方法

1.4.1 铜绿假单胞菌肺炎小鼠动物模型建立及动物分组将90只小鼠随机分为空白组、PA组、免疫抑制组、免疫抑制+PA组及免疫抑制+PA+白藜芦醇组(依次命名为A、B、C、D、E组)，每组各18只。所有动物均饲养于无菌动物房，给予无菌饲料及无菌水喂养。经过一周适应性饲养后，如先前所述[10]，经过一定修改后于实验第1、3、5天腹腔注射环磷酰胺150mg/kg，建立免疫抑制模型，对照组腹腔注射等量无菌PBS液。于实验第6天，在小鼠每侧鼻孔滴入10μL PA悬液(1×109CFU/mL)，将小鼠竖立30s左右，保证菌液在肺部均匀分布，建立PA模型(对照组给予等量无菌PBS液)。二者结合建立免疫抑制+PA模型。根据李明等[11]研究结果，使用无菌生理盐水将白藜芦醇配置成25μmol/L的浓度，在免疫抑制+PA模型建立后立即以10mL/kg白藜芦醇的剂量腹腔注射，即为免疫抑制+PA+白藜芦醇组。本研究符合动物伦理要求，并经医院伦理委员会审核批准。

1.4.2 样本采集各组小鼠于造模成功后4、8及24h后分批处死，每组每个时间点随机选取6只。小鼠经过量麻醉后处死，经眼眶收集外周血1mL左右，离心收集血清，置于-80℃中保存备用。完整取出小鼠肺组织，左肺置于甲醛中固定，右肺液氮速冻后，置于-80℃中保存。

1.4.3 外周血IL-17浓度检测取各个时间点的冻存血清，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-17浓度，每个标本设置3个复孔，酶标仪读取各孔吸光度(OD450)，取平均值。

1.4.4 肺组织病理学检测及评分取出各个时间点固定在甲醛中的小鼠肺组织，经过包埋、切片，HE染色后在光学显微镜下观察病理学变化，并根据急性肺损伤评分标准，从肺内毛细血管淤血、肺泡腔纤维蛋白渗出、中性粒细胞浸润、气道黏膜上皮脱落、肺泡间隔增宽等5方面，按病变程度分为5级评分，0分：无，1分：可疑，2分：轻度，3分：明显，4分：重度改变。

1.4.5 qRT-PCR检测SIRT1、RORγt mRNA表达水平用Trizol法提取24h时间点各组小鼠肺组织总RNA，使用Nanodrop检测RNA浓度及纯度，然后使用逆转录试剂盒合成cDNA，进行qRT-PCR检测。使用primer premier 5.0软件设计荧光定量PCR引物(表1)，并由上海生工生物工程有限公司合成。qRT-PCR的反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，共40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。其中，以GADPH为内参基因。

表1 SIRT1、RORγt、GADPH引物序列

1.4.6 Western blot法检测SIRT1、RORγt蛋白表达水平选取24h时间点各组小鼠，提取肺组织总蛋白，Western blot检测SIRT1、RORγt蛋白表达水平，以GAPDH为内参蛋白。

2 结果

2.1 白藜芦醇对外周血IL-17浓度的影响在同一时间进行比较，结果发现各个时间点，与空白组相比，PA组和免疫抑制组小鼠血清中IL-17含量均显著升高(P<0.05)；与免疫抑制组相比，免疫抑制+PA组小鼠血清中IL-17含量均显著升高(P<0.05)；与免疫抑制+PA组相比，免疫抑制+PA+白藜芦醇组血清中IL-17含量均显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 血清中IL-17检测结果

2.2 白藜芦醇对肺组织病理学的影响 HE染色后，光学显微镜下可观察到，空白组各时间点肺泡结构完整，肺泡腔内无明显渗出物和炎性细胞浸润，肺泡间隔均一，无出血和水肿。免疫抑制组肺泡结构较为完整，部分有少许炎性细胞浸润。PA组和免疫抑制+PA组肺泡结构严重破坏，肺泡内可见大量中性粒细胞浸润，肺间质水肿，肺泡隔增厚，增宽。白藜芦醇处理组肺组织的病理症状减轻，且随着时间的增加，症状越来越轻，见图1。

图1 24h时间点小鼠肺组织HE染色结果(100×)

2.3 白藜芦醇对肺组织病理学评分的影响与空白组相比，PA组和免疫抑制组小鼠肺组织病理学评分显著升高(P<0.05)；与免疫抑制组相比，免疫抑制+PA组小鼠肺组织病理学评分显著升高(P<0.05)；与免疫抑制+PA组相比，免疫抑制+PA+白藜芦醇组肺组织病理学评分显著降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组小鼠肺组织病理学评分

2.4 白藜芦醇对SIRT1、RORγt mRNA表达水平的影响造模成功后24h，与空白组相比，PA组和免疫抑制组小鼠肺组织RORγt mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与免疫抑制组相比，免疫抑制+PA组小鼠肺组织RORγt mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与免疫抑制+PA组相比，免疫抑制+PA+白藜芦醇组肺组织RORγt mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，SIRT1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，见表4。

表4 24h时间点各组小鼠SIRT1、RORγt mRNA表达水平

2.5 白藜芦醇对SIRT1、RORγt蛋白表达水平的影响造模成功后24h，与空白组相比，PA组和免疫抑制组小鼠肺组织RORγt蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与免疫抑制组相比，免疫抑制+PA组小鼠肺组织RORγt蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与免疫抑制+PA组相比，免疫抑制+PA+白藜芦醇组肺组织RORγt蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图2、表5。

表5 24h时间点各组小鼠SIRT1、RORγt蛋白表达水平

图2 24h时间点各组小鼠SIRT1、RORγt蛋白WB检测结果

3 讨论

PA是引起医院获得性肺炎最常见的革兰氏阴性菌之一[12]，生长繁殖所需营养条件低，抵抗力强，耐药性强。当PA感染机体后，机体会启动自身免疫机制，释放相应的炎症介质，促进机体的炎症和损伤。TH17细胞是新发现的一类CD4+T细胞亚群，能通过分泌IL-17等细胞炎症因子激活机体炎症反应[13-14]。IL-17作为Th17细胞特异性细胞分子，通过结合Act1、TRAF6等受体而促进多种趋化因子及基质蛋白分泌，招募大量中性粒细胞聚集，引起炎性反应，导致组织器官的炎性损伤[15-16]。环磷酰胺为临床上常用免疫抑制药物，能够影响机体免疫反应，造成机体免疫功能低下。本研究使用环磷酰胺制备免疫抑制小鼠模型，并在此基础上制备PA感染肺炎模型，可观察到肺炎小鼠毛发紊乱，行动缓慢，反应迟钝，呼吸急促，采食量减少，镜下可见PA组和免疫抑制+PA组小鼠肺组织损伤严重，肺泡结构被破坏，同时大量中性粒细胞和炎性细胞浸润，肺泡壁增宽、充血，小鼠肺组织病理学评分及血清中IL-17的含量显著升高，表明PA感染免疫抑制小鼠，小鼠肺组织的病理变化严重，炎症反应明显，揭示小鼠模型建立成功。

白藜芦醇是一种天然植物多酚，具有广泛的药理活性，在抗炎症方面效果显著。黄晓军等[17]研究发现，白藜芦醇可降低急性肺损伤模型小鼠血清中促炎症介质水平，从而减轻急性肺损伤的炎症程度。李明等[11]研究发现，白藜芦醇可以抑制呼吸道合胞病毒所致的信号通路激活，从而减轻炎症反应，发挥对肺损伤的保护作用。本研究发现，PA诱导的免疫抑制肺炎小鼠经白藜芦醇处理后，小鼠肺组织病理症状减轻，中性粒细胞和炎性细胞减少，肺组织病理学评分和血清中IL-17的含量显著降低，且随着时间增加，症状减轻更明显，表明白藜芦醇可减轻PA诱导的免疫抑制肺炎小鼠的肺组织病变，减轻炎症反应，且随着时间的增加，效果更显著。

SIRT1为广泛存在于哺乳动物NAD+依赖的去乙酰化酶，与炎症反应有关。RORγt是TH17细胞分化过程中的关键转录因子，抑制RORγt表达可直接抑制未致敏T细胞向TH17细胞分化，进而降低TH17细胞水平，减轻炎症反应[18-19]。本研究结果显示，与空白组相比，免疫抑制+PA组小鼠肺组织RORγt mRNA和蛋白表达水平显著升高，SIRT1mRNA和蛋白表达水平显著降低，表明上调RORγt蛋白，下调SIRT1蛋白，可能与小鼠炎症反应增强有关，加剧小鼠肺组织损伤。白藜芦醇为去乙酰化酶SIRT1最有效的激活剂之一，具有明显促进SIRT1激活作用[20]。李传文等[21]研究发现，白藜芦醇使SIRT1激活可促进脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损恢复，减轻炎症反应。李方等[8]研究发现，白藜芦醇可明显提高大鼠肾组织SIRT1蛋白表达水平，减轻炎症反应。本研究中，免疫抑制+PA组小鼠经过白藜芦醇处理后，RORγt的mRNA和蛋白表达水平显著降低，SIRT1mRNA和蛋白表达水平显著升高，表明白藜芦醇可促进SIRT1表达，抑制RORγt表达，进而抑制未致敏T细胞向TH17细胞分化，降低TH17细胞水平，减轻炎症反应，发挥保护作用。