阿魏酸钠对神经病理痛大鼠痛觉的改善及对p38MAPK信号通路的影响*

2021-11-24张爱霞卢晶吴饶平

西部医学 2021年11期

张爱霞卢晶吴饶平

(江西卫生职业学院基础学科部，江西南昌，330052)

神经病理痛是指中枢神经或外周神经系统病变引起的疼痛综合征，以物理性的机械损伤、代谢或营养障碍、病毒感染、神经递质功能障碍为常见病因，主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏，是慢性疼痛的常见类型[1-3]。神经病理痛的发病机尚未明确，临床防治措施有限，明确其发生机制、探索有效的治疗方法是镇痛相关研究的热点。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，MAPK)是MAPKs家族成员，参与细胞的生长、发育、细胞间功能同步等多种生理过程，与炎症、应激反应的调控密切相关[4-5]。研究显示，在神经病理性大鼠脊髓中有p38MAPK表达和活性增高的情况[6]。阿魏酸钠是中药中的有效单体成分，具有镇痛、抗炎、清除自由基、增强免疫等作用，在神经变性、心血管等疾病中有广泛应用[7-8]。研究证实，阿魏酸钠对大鼠炎症性疼痛及小鼠化学疼痛均有较好的镇痛作用，但其在神经病理痛中的作用机制仍需进一步明确[9]。本研究通过分析阿魏酸钠对神经病理痛大鼠痛觉改善作用及对p38MAPK信号通路的影响，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级健康SD雄性大鼠40只，8周龄，体质量220～240 g，购于南通大学实验动物中心[SCXK(苏)2014-0001]。本研究经实验动物管理与使用委员会(institutional animal care and use committee，IACUC)审核批准(IACUC-20190105-01)，实验动物使用按照3R原则给予人道的关怀。

1.2 试剂及仪器阿魏酸钠(大连美仑生物公司，纯度≥99%)，p38MAPK抑制剂SB203580(上海爱必信生物科技有限公司)，BCA蛋白定量分析试剂盒(上海远慕生物科技有限公司)、ECL显影液(美国Thermo公司)，SP免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司)，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)ELISA试剂盒(合肥莱尔生物科技有限公司)，兔抗鼠p38MAKP、cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding，CREB)、磷酸化(phosphorylation，p)-p38MAKP、p-CREB单抗及HRP标记的二抗(美国Abcam公司)，BME-410C型全自动热痛刺激仪(中国医学科学院生物研究所)，BW-VonFrey机械刺痛测试包(上海软隆科技发展有限公司)，Elx 800酶标仪(美国Bio-Tek公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型建立及分组干预 40只SD雄性大鼠适应性饲养1周，根据体质量以随机数字表法分为假手术组、模型组、p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组，每组10只。坐骨神经结扎损伤(chronic constriction injury，CCI)模型建立[10]：4组大鼠以硫喷妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，无菌条件下切开大鼠左后肢大腿后外侧皮肤，钝性分离坐骨神经，以4-0丝线结扎坐骨神经4道，每个结扎线间隔1 mm，结扎过程中可见肢体轻微抽动，注意避免结扎过紧阻断神经外周血流，假手术组暴露坐骨神经后不予以结扎处理，完毕后逐层缝合，以疼痛行为学检测中机械性缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)、热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)较术前缩短为建模成功；排除术后后肢瘫痪、死亡鼠，模型组1只术后术肢瘫痪剔除。术后每组大鼠肌肉注射青霉素8×104U预防感染，复苏后单笼喂养。p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组术后当天分别以p38MAPK抑制剂SB203580 1 mg/kg、阿魏酸钠50 mg/kg，按2 mL/kg体质量腹腔注射，1次/d，连续7 d，假手术组和手术组则予以注射等量生理盐水。

1.3.2 机械诱发痛检测分别于建模前1 天及建模后1、3、7 天固定时间段使用BW-VonFrey机械刺痛测试包检测大鼠左后肢MWT。将大鼠置于底部有金属网的有机玻璃箱中，适应15 min后，以VonFrey丝刺激左后肢足底5 s，刺激强度以触丝弯曲为准，按照up-down法，选择8根VonFrey丝，折力分别为0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g，以引起抬足或舔足反射的最小刺激折力为MWT，首先以0.6 g力度刺激，若该力度不足以引起抬足或舔足行为则逐级加大力度，测定3次取平均值。

1.3.3 热刺激诱发痛检测机械诱发痛阈检测后应用BME-410A热辐射疼痛刺激仪检测各组大鼠左后肢TWL，有机玻璃箱置于3 mm厚度的玻璃板上，以BME-410C型全自动热痛刺激仪照射大鼠足底，调节刺激光源强度为55℃，开始照射至大鼠抬腿回避时间为TWL，设置自动切断时间为25 s避免组织灼伤，测定3次取平均值。

1.3.4 组织取材及大鼠脊髓背角5-HT、GABA浓度检测建模后第7天疼痛行为学检测后处死大鼠，在冰台上快速取脊背左侧L4～6脊脊髓背角组织，保存于-80℃冰箱中备用。ELISA法检测脊髓背角5-HT、GABA浓度浓度：取低温保存的大鼠脊髓背角组织0.1 g，置于研钵中，分3次加液氮反复研磨成粉末，加入PBS缓冲液1 mL，充分匀浆，取上层清液，按照ELISA试剂盒步骤操作，使用酶标仪于450 mm波长处检测光密度值，计算5-HT、GABA浓度。

1.3.5 p38MAPK、p-p38MAPK、CREB、p-CREB蛋白相对表达量检测 Western blot检测p38MAPK、p-p38MAPK、CREB、p-CREB蛋白相对表达量：取低温保存的脊髓背角组织，提取总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，10%SDS-PAGE电泳，电转仪转膜3 h，加入脱脂奶粉室温封闭2 h，PBS洗涤后加入一抗(1∶800稀释)，摇床4℃孵育过夜，含吐温的TBS洗涤，加入二抗(1∶1 000稀释)，常温孵育2 h，化学发光显色，暗室中曝光，使用凝胶成像系统拍照，Image J软件分析灰度值，以p38MAPK、p-p38MAPK、CREB、p-CREB蛋白与内参β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 大鼠不同时间MWT比较建模后1、3、7 d与假手术组比较，p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组、模型组的MWT下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组比较，模型组建模后1、3、7 d的MWT下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与建模前1 d比较，p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组、模型组建模后1、3、7 d的MWT下降，差异有统计学意义(P<0.05)；假手术组的MWT建模前后随时间的延长无明显变化(P>0.05)，p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组的MWT建模后随时间的延长无明显变化(P>0.05)，模型组的MWT随时间的延长而下降(P<0.05)，见图1。

图1 不同时间点MWT变化

2.2 大鼠不同时间TWL比较建模后1、3、7 d与假手术组比较，p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组、模型组的TWL缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组比较，模型组建模后1、3、7 d的TWL缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与建模前1 d比较，p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组、模型组建模后1、3、7 d的TWL缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；假手术组的TWL建模前后随时间的延长无明显变化(P>0.05)，p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组的TWL建模后随时间的延长无明显变化(P>0.05)，模型组的MWT随时间的延长而缩短(P<0.05)，见图2。

图2 不同时间点TWL变化

2.3 大鼠脊髓背角5-HT、GABA浓度比较大鼠脊髓背角组间5-HT、GABA浓度比较，差异有统计学意义(P<0.001)；与假手术组比较，p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组、模型组的5-HT、GABA浓度更低，差异有统计学意义(P<0.05)；与p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组比较，模型组的5-HT、GABA浓度更低，差异有统计学意义(P<0.05)；p38MAPK抑制组与阿魏酸钠组5-HT、GABA浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 大鼠脊髓背角5-HT、GABA浓度比较

2.4 大鼠脊髓背角p38MAPK、p-p38MAPK、CREB、p-CREB蛋白表达情况比较大鼠脊髓背角组间p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB比较，差异有统计学意义(P<0.001)；与假手术组比较，p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组、模型组的p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB更高，差异有统计学意义(P<0.05)；与p38MAPK抑制组、阿魏酸钠组比较，模型组的p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB更高，差异有统计学意义(P<0.05)；p38MAPK抑制组与阿魏酸钠组p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图3。

图3 蛋白免疫印记图

表2 大鼠脊髓背角p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB比较

3 讨论

疼痛是机体受到刺激时出现的伤害性感觉，涉及复杂的生理心理机制，可分为伤害性和神经病理性[11-12]。伤害性疼痛多在伤害性刺激消失后随之消失或缓解，而神经病理痛多为慢性顽固性疼痛，如神经受压、糖尿病神经痛、带状疱疹后神经痛、腰腿痛等有神经系统参与的慢性疼痛，具有迁延、反复发作的特点[13-14]。目前化学药物是治疗疼痛的主要手段，阿片类药物、水杨酸类、非甾体类等镇痛药物存在依赖性、呼吸抑制、胃肠道刺激等缺陷。随着现代中医学的发展，止痛类中药草因毒副作用小、止痛效果好等优势获得认可。阿魏酸钠为桂皮酸衍生物，在当归、川芎、酸枣仁、桃仁等活血止痛类中草药中的有效成分，其镇痛作用被证实，但关于对神经病理痛的相关研究较少。本研究通过建立神经病理痛大鼠模型，并以阿魏酸钠干预，探讨阿魏酸钠对神经病理痛的痛觉改善作用及机制，以期为神经病理痛的治疗及药物研发提供参考。

阿魏酸钠作为血止痛类中草药中的有效成分，在血管性疾病及疼痛类疾病治疗中有广泛应用，能抑制血小板的聚集和血管平滑肌痉挛，改善微循环，并有抗炎、免疫调节、解痉、止痛和增强免疫等作用[15]。研究显示，阿魏酸钠能改善糖尿病周围神经病变，并可抑心肌细胞的重塑[16]。脊髓背角是疼痛信息传递和整合的初级中枢，此部位神经元的敏感化可直接易化疼痛信号传递至大脑，产生痛觉敏化[17]。5-HT是参与机体痛觉下行通路镇静机制中的主要神经活性物质[18]。GABA是脊髓中间神经元突触释放的抑制性神经递质，神经细胞结构功能的改变和重塑可导致GABA的释放减少，削弱对伤害性信息的抑制作用，产生疼痛[19]。在内源性痛觉下行调控系统中GABA通过5-HT能下行投射纤维在脊髓中发挥镇痛作用[20]。本研究中阿魏酸钠组建模后的MWT低于假手术组而高于模型组，TWL短于假手术组而长于模型组，提示阿魏酸钠能减轻减轻CCI模型大鼠机械超敏和热痛过敏；且阿魏酸钠组脊髓背角5-HT、GABA的含量低于假手术组而高于模型组，证实阿魏酸钠能提高脊髓背角5-HT、GABA的含量，增加对伤害性感觉系统的抑制作用，参与中枢神经的镇痛。

p38MAPK信号通路是细胞内外信息交流的重要通路，参与细胞的生长、分裂、死亡等多种生物学功能，可在伤害性刺激、生长因子及炎症介质等因素影响下被激活，参与多种神经病理痛的形成[21-22]。研究显示，p38MAPK可在慢性神经病理痛状态下被激活，参与慢性神经病理痛的产生和维持[23]。磷酸化的p38MAPK能作用于下游磷脂酶A2和过氧化酶2生成前列腺素物质，发生痛觉过敏。CREB属于核内转录因子，是细胞内激酶的底物，可由活化的p38MAPK激活，启动靶蛋白的基因转录，促进自发性疼痛、痛觉过敏、痛觉超敏的产生[24]。朱春燕等研究证实，活化的P38MAPK信号通路参与大鼠骨癌痛痛觉过敏的发生[25]。另有研究显示，阿魏酸钠可通过抑制p38MAPK信号通路的活化，下调炎症级联反应[26]。本研究结果中，p38MAPK抑制组建模后的MWT及脊髓背角5-HT、GABA浓度均低于假手术组而高于模型组，TWL短于假手术组而长于模型组，说明p38MAPK信号通路参与神经病理痛的发生；此外阿魏酸钠组及p38MAPK抑制组p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB均高于假手术组而低于模型组，而阿魏酸钠组与p38MAPK抑制组比较无统计学差异，说明阿魏酸钠可能通过抑制p38MAPK信号通路的活化，改善神经病理痛。