基于HPLC-DAD-ELSD串联法同时测定麝香保心丸中8种成分的含量*

石 磊，谭广山

（聊城市人民医院，山东 聊城 252000）

麝香保心丸来源于《太平惠民合剂局方》，是由人工麝香、人参提取物、人工牛黄、肉桂、苏合香、蟾蜍和冰片7味中药材经过加工制备组成[1]。该方有芳香温通、益气强心的功效，临床上主要用于气滞血瘀所致的胸痹，如心前区疼痛、固定不移、心肌梗死等。从药材组成上看，该方既有挥发性有效成分，又有非挥发性有效成分；既有紫外检测器可检测的有效成分，又有无紫外吸收的有效成分，这便为该制剂的质量评价带来巨大挑战。如何建立一种准确、快速、全面的评价方法，是目前亟需解决的主要内容。

随着检测技术的不断更新与发展，二极管阵列和蒸发光散射检测器联用（DAD-ELSD）被广泛应用于中药复杂复方的质量控制中，如当归补血汤、复方丹参片、肾康灵颗粒等[2-4]，已成为中药质量评价体系中一种重要的检测手段。目前，麝香保心丸已被收载于2020年版《中华人民共和国药典》（一部）中，并对该方中蟾酥（华蟾酥毒基和酯蟾毒配基总量）和人参总提取物（人参皂苷Rg1和人参皂苷Re总量）的含量测定做了明确规定。但这2种药材需分别处理样品和检测，色谱条件及流动相体系也不相同，检测较为耗时。而且仅对方中2味中药进行质量控制，无法全面保证麝香保心丸的有效性、安全性和稳定性。

麝香保心丸中使药冰片和君药麝香为人工配比合成的，所含主要成分含量较为稳定；佐药牛黄多为半人工制品；臣药人参、苏合香和佐药蟾酥、肉桂四者均为天然药材。因此，应对天然药材和半人工制品中的主要活性成分进行质量控制。佐药人工牛黄的主要活性成分为胆酸类成分，如胆酸；佐药蟾酥强心止痛的主要活性成分为强心甾类，如华蟾酥毒基、酯蟾毒配基；臣药人参提取物主要活性成分为皂苷类，如人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2；而臣药苏合香和佐药肉桂中的主要活性成分有重叠，如肉桂酸，但苯甲酸苄酯仅臣药苏合香中含有[5-6]。故本研究采用HPLC-DAD-ELSD串联法建立了同时检测麝香保心丸中苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基8种指标性成分含量的方法，为评价麝香保心丸的质量提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器（DAD），四元梯度泵，Empower Pro色谱工作站（美国安捷伦科技有限公司）；Alltech蒸发光散射检测器（ELSD）3300（格雷斯中国有限公司）；XS205DU型电子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司）；KQ5200 DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli Pore Advantage A10自动纯水机（密理博中国有限公司）。

1.2 材料 蟾毒灵对照品（批号：111981-201503，纯度：98.0%）、人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201424，纯度：93.7%）、人参皂苷Rb2对照品（批号：111715-201203，纯度：93.8%）（中国食品药品检定研究院）；蟾毒他灵对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：150809，纯度：98.3%）；苯甲酸苄酯对照品（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20150621，纯度：98.0%）；华蟾酥毒基对照品（批号：110803-200605，纯度：100.0%）、酯蟾毒配基（批号：10718-200507，纯度：100.0%）、胆酸对照品（批号：100078-200414，纯度：100.0%）（中国药品生物制品检定所）；5批麝香保心丸（上海和黄药业有限公司，批号：20200410，20200513，20200523，20200607，20200705，规格：每丸重22.5mg）；纯化水（屈臣氏）；乙腈（色谱纯，Merk公司）；二氯甲烷、甲醇等试剂（分析纯，天津化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters XBridgeTMC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序：0～10 min，20%A；10～25 min，20%→32%A；25～35 min，32%→40%A；35～50 min，40%→70%A；50～65 min，70%→100%A；DAD（苯甲酸苄酯、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒他灵、蟾毒灵）检测波长：280 nm，柱温：30 ℃，体积流量：0.8 mL/min；进样量：10 μL；ELSD（胆酸、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2）漂移管温度：40 ℃，载气流量：1.5 L/min。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取苯甲酸苄酯对照品5.65 mg、华蟾酥毒基对照品4.55 mg、酯蟾毒配基对照品4.67 mg、蟾毒他灵对照品4.58 mg、蟾毒灵对照品4.99 mg、胆酸对照品4.57 mg、人参皂苷Rb1对照品4.08 mg、人参皂苷Rb2对照品5.01 mg，分别置100 mL的容量瓶中加混合溶剂[甲醇（V）∶二氯甲烷（V）∶水（V）=4∶2∶0.5]溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为55.370、45.500、46.700、45.021、48.902、45.700、38.230、46.990 μg/mL对照品贮备溶液。

2.3 供试品溶液的制备 称取麝香保心丸细粉0.5 g，精密称定质量，置25 mL的具塞锥形瓶中，精密量取10 mL混合溶剂[甲醇（V）:二氯甲烷（V）∶水（V）=4∶2∶0.5]，缓缓加入后称定总质量，低温超声提取25 min，放冷后再称质量，补足减失的溶剂质量，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。

2.4 阴性对照品溶液制备 按麝香保心丸各药材用量比例及制剂工艺流程分别制备缺牛黄和人参药材，以及缺蟾酥和苏合香药材的阴性对照品，再按已定的样品制备方法分别制备缺牛黄和人参药材，以及缺蟾酥和苏合香药材的阴性对照品溶液。

2.5 系统适用性试验 精密吸取已制备好的对照品溶液和供试品溶液各10 μL，并按“2.1”项下高效液相色谱条件进样，最后记录色谱图。（见图1）结果显示，苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基8个色谱峰的分离度均良好，表明所建立的HPLC法满足测试要求。

图1 HPLC 图

2.6 线性关系、定量限和检出限 分别精密吸取0.25、0.50、1.25、2.50、5.00 mL的苯甲酸苄酯（55.370μg/mL）、胆酸（45.700μg/mL）、蟾毒他灵（45.021 μg/mL）、蟾毒灵（48.902μg/mL）、人参皂苷Rb1（38.230 μg/mL）、人参皂苷Rb2（46.990 μg/mL）、华蟾酥毒基（45.500 μg/mL）、酯蟾毒配基（46.700 μg/mL）混合对照品贮备液，置于5 mL的容量瓶中，滴加混合溶剂[甲醇（V）∶二氯甲烷（V）∶水（V）=4∶2∶0.5]定容至刻度线，即可得到不同质量浓度的苯甲酸苄酯对照品溶液、胆酸对照品溶液、蟾毒他灵对照品溶液、蟾毒灵对照品溶液、人参皂苷Rb1对照品溶液、人参皂苷Rb2对照品溶液、华蟾酥毒基对照品溶液和酯蟾毒配基对照品溶液，按既定的色谱条件吸取10 μL分别依次进样，根据峰面积计算含量。即苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的质量（X，μg）分别为横坐标，各自的峰面积积分值（Y）分别为纵坐标，并分别计算得出各标准曲线的回归方程和相关系数。结果显示，8种成分的线性关系在各自相应的质量浓度范围内有良好的相关性。以3倍信噪比（S/N=3）计算仪器的检出限，以10倍信噪比（S/N=10）计算仪器的定量限。（见表1）

表1 8 种化学成分线性关系、检测限和定量限

2.7 精密度试验 取同一样品，按“2.3”项下制备供试品溶液的方法及“2.1”项下HPLC条件操作，连续进样6次，测定各化学成分的含量。结果苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含有量RSD分别为1.05%、0.96%、1.03%、1.05%、1.18%、1.13%、1.23%、1.48%，表明本方法精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一样品，按“2.3”项下制备供试品溶液的方法操作，分别于0、2、4、6、8、12 h注入HPLC色谱仪。结果苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基各成分的峰面积RSD分别 为1.09%、1.32%、1.13%、0.99%、0.96%、1.02%、1.05%、1.01%，表明供试品溶液中8种成分在12 h内有良好的稳定性。

2.9 重复性试验 取同一样品共6份，按“2.3”项下供试品制备方法及“2.1”项下HPLC条件操作，分别进样分析。结果苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含有量RSD分别为1.02%、1.05%、1.03%、1.09%、0.99%、0.92%、1.08%、1.04%，表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 取同一供试品（批号：20200410）约0.25 g，平行9份，精密称定质量，分别置50 mL锥形瓶中，每组分别加入苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品储备液，加入量约为样品中各含量的50%、100%和150%，按“2.3”项下制备供试品溶液的方法及“2.1”项下HPLC条件操作分别进样，计算回收率。苯甲酸苄酯平均回收率（n=9）为99.98%，RSD为0.86%；胆酸平均回收率（n=9）为100.09%，RSD为0.65%；蟾毒他灵平均回收率（n=9）为99.98%，RSD为0.66%；蟾毒灵平均回收率（n=9）为101.95%，RSD为0.92%；人参皂苷Rb1平均回收率（n=9）为99.50%，RSD为0.40%；人参皂苷Rb2平均回收率（n=9）为100.09%，RSD为0.69%；华蟾酥毒基平均回收率（n=9）为99.89%，RSD为0.66%；酯蟾毒配基平均回收率（n=9）为99.99%，RSD为0.62%，表明加样回收试验结果良好，基本符合方法学要求。（见表2）

表2 8 种成分加样回收率实验结果（n=9）

续表2：

2.11 含量测定 取5批麝香保心丸，按照已定的供试品制备方法及HPLC条件操作，分别进样分析，记录峰面积，计算苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基各自含量。（见表3）

表3 5 批样品中8 种化学成分含量测定结果（，mg/g）

表3 5 批样品中8 种化学成分含量测定结果（，mg/g）

3 讨论

3.1 有效成分的选择 麝香保心丸是经过水液煎煮提取、浓缩等一系列复杂制备工艺制备而成的中药复方制剂，该方中各组分协同作用[7-8]。笔者根据制剂配伍的君臣佐使原则，结合该复方的药理文献报道[9-11]，选择可能发挥疗效的蟾酥（华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒他灵、蟾毒灵）、苏合香（苯甲酸苄酯）、人参提取物（人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2）和人工牛黄（胆酸）中的8种成分为定量指标，采用HPLC-DAD-ELSD法同时测定8种指标性成分的含量。结果显示，8种成分在已定的色谱条件和检测条件下分离度均良好。本次研究为该复方制剂临床的有效性与质量保持相一致提供了科学依据。

3.2 样品处理方法和检测波长的优选 参照《中华人民共和国药典》中对麝香保心丸的处理方法处理样品，结果发现，该供试品溶液处理方法可使样品中苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基提取完全。且根据《中华人民共和国药典》和相关文献报道[12-15]，华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒他灵、蟾毒灵、苯甲酸苄酯在波长280 nm处均有吸收，而在此波长下无法检测出胆酸、参皂苷Rb1和人参皂苷Rb2。故本次实验选择HPLCDAD-ELSD法同时对苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基8种化学成分进行定量分析。

3.3 色谱条件的选择 本研究分别考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.5%冰乙酸水、乙腈-0.5%甲酸水4种流动相系统，结果显示，以乙腈-0.5%甲酸水溶液为本次实验的流动相进行梯度洗脱时，苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基8种成分的分离效果均呈良好效果；分别考察了不同温度（25 ℃、30 ℃、35 ℃）和不同体积流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）对各色谱峰分离效果的影响，结果显示，柱温30 ℃、体积流量0.8 mL/min时基线较平稳、分离度和峰形可以达到较好的效果；考察了不同厂家和品牌的色谱柱5 μm）、Waters XBridgeTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo BDS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]，结果显示，Waters XBridgeTM C18柱能将8种指标性成分，即苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的色谱峰分开，并达到良好的分离度。

3.4 样品含量分析 通过HPLC-DAD-ELSD串联法对5批麝香保心丸中8种成分同时测定，结果显示，不同批次之间有4种成分差异较小，即苯甲酸苄酯含量为0.905～0.911 mg/g，相当于每丸含20.36～20.49 μg；胆酸含量为0.701～0.713 mg/g，相当于每丸含15.77～16.04 μg；人参皂苷Rb1含量为0.302～0.308mg/g，相当于每丸含6.80～6.93μg；酯蟾毒配基含量为0.512～0.518mg/g，相当于每丸含11.52～11.67 μg。而不同批次之间的另外4种有效成分含量差异略大，即蟾毒他灵含量为0.782～0.805 mg/g，相当于每丸含17.60～18.11 μg；蟾毒灵含量为0.801～0.898 mg/g，相当于每丸含18.02～20.21μg；人参皂苷Rb2含量为0.506～0.518 mg/g，相当于每丸含11.39～11.66 μg；华蟾酥毒基含量为0.535～0.588 mg/g，相当于每丸含12.04～13.23 μg。其中，5批样品均符合《中华人民共和国药典》中关于麝香保心丸的规定，即麝香保心丸每丸含中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的总量计应为18～56 μg。以上结果表明，本研究所建立的同时测定多指标方法，快速、准确、分离良好，可用于评价麝香保心丸产品质量稳定性及批次的均一性。

4 小结

本研究建立了HPLC-DAD-ELSD串联法同时测定麝香保心丸中苯甲酸苄酯、胆酸、蟾毒他灵、蟾毒灵、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的方法，通过HPLC分离参数的考察，选择最理想的HPLC分离条件，同时对样品的精密度、稳定性、重复性及加样回收率进行了考察。该方法能较为客观、准确、全面地测定不同活性成分的含量。本研究通过对麝香保心丸蟾酥、苏合香、人工牛黄和人参提取物4味药材中的有效成分同时进行测定，实现了仅用一种检测方法同时控制4味药材的质量，不仅为提高麝香保心丸的内在质量实验数据，也为其他中药复方制剂的质量控制与评价提供了借鉴。