山苓荷甘酵素发酵前后降血脂及降血糖药效的对比研究*

刘 斌，瞿昊宇，陈光宇，谢梦洲

（1.湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

酵素是指选取一种或多种新鲜水果、蔬菜、食用菌、中草药为基础原料，经乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多种有益菌发酵而使原材料生物活性增强或产生新的生物活性的物质[1]。关于酵素的研究最早于20世纪初起源于日本，后来发展到欧美地区，成为了成熟的产业，有上千万消费者每天服用酵素产品[2]。近30年来，中国人群的血脂水平逐步升高，血脂异常患病率明显增加。2012年全国调查结果显示[3]，中国成人血脂异常总体患病率高达40.40%，较2002年呈大幅度上升[4]。高脂血症是导致动脉粥样硬化进而形成心脑血管事件的主要因素之一，有效防治血脂异常是预防心脑血管疾病的重要途径[5-8]。目前的治疗药物对肝脏有一定损害及副作用，故不适合长期服用，患者顺应性差。因此选取药食同源中药,开发具有防治高脂血症的保健食品具有广阔的市场前景和重要的社会意义。山苓荷甘酵素处方来自湖南中医药大学中医药膳学及药食同源功能性食品研究专家谢梦洲创制的药食同源中医药膳方[9]，由山楂、山药、茯苓、荷叶、甘草5味具有降血脂作用的药食同源中药组成，经提取、浓缩、植物乳酸杆菌发酵、干燥制成。前期研究[3]发现本方中具有降血脂作用的多糖类成分发酵后含量明显高于发酵前，而同样具有降血脂作用的总黄酮、荷叶碱、金丝桃苷、熊果酸几种成分发酵前后含量变化不明显，发酵过程对降血脂药效的影响无法仅从测定降血脂活性成分的含量结果推断。为阐明发酵对降血脂药效的影响及发酵的意义，本研究选用高脂高糖模型SD大鼠对山苓荷甘酵素发酵前低剂量（临床剂量）和中剂量（临床剂量×2）与发酵后低剂量和中剂量进行降血脂药效（TC、TG、LDL-L、HDL-C）及降血糖（GLU）药效比较，现报告如下。

1 材 料

1.1 动物 SPF级健康成年雄性SD大鼠，体质量180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2020-0002。实验动物质量合格证号：1107271911005758，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004；在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2015-0016。实验期间环境温度20～26℃，湿度40%～70%。

1.2 材料与试剂 辛伐他汀片（批号：201006，默沙东公司）；山楂（批号：191203831）、荷叶（批号：20200510）、甘草（批号：20200105）、山药（批号：191204751）、茯苓（批号：20191226）药材饮片均购自康美药业股份有限公司，经王智教授鉴定符合2015年版《中华人民共和国药典》有关规定；植物乳酸杆菌CICC21790（中国工业微生物菌种保藏管理中心）；MRS肉汤培养基BS1137（杭州百思生物技术有限公司）；山苓荷甘酵素发酵前后4个样品由本实验室制备。GLU测定试剂盒（批号：208085）、TG测定试剂盒（批号：205015）、TC测定试剂盒（批号：208074）、LDL-C试剂盒（批号：208085）、HDL-C试剂盒（批号：208093）均购自日本和光纯药工业株式会社。

1.3 仪器与设备 IMaik酶标仪（伯乐生命医学产品上海有限公司）；ATX124型电子天平（东京岛津仪器有限公司）；HTP-312型电子天平（上海花潮电器有限公司）；LABOSPECT003型自动生化分析仪（美国MD公司）。

2 实验方法

2.1 山苓荷甘提取物和酵素的制备方法 山苓荷甘提取物的制备：山楂、荷叶、甘草混匀，加入70%乙醇浸泡后回流提取2次，分别过滤，合并2次滤液[10]，50 ℃减压浓缩至无醇味；山药、茯苓混匀，加水浸泡1 h，提2次，分别过滤，滤液与醇提浓缩液合并[11]，50 ℃减压浓缩至每1 mL相当于药材2 g，-80 ℃冰箱保存。山苓荷甘酵素的制备：提取浓缩方法同山苓荷甘提取物，将每1 mL相当于药材2 g的浓缩液121 ℃灭菌25 min，无菌条件下在灭菌液中加入2%的双歧杆菌菌粉，在37 ℃培养72 h发酵，发酵液置-80 ℃冰箱保存[12-13]。

2.2 动物分组及给药剂量 将70只SPF级健康成年雄性SD大鼠按体质量随机分为7组：山苓荷甘发酵前中、低剂量组，山苓荷甘发酵后中、低剂量组，空白对照组，高脂血症模型组，辛伐他汀阳性对照组，每组10只。高脂血症模型组及山苓荷甘发酵前后各剂量组大鼠给予高脂饲料（78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.2%胆盐），并按5 mL/kg剂量给予生理盐水。山苓荷甘发酵前后低剂量组大鼠分别按2.5 mL/kg（相当于给药量5 g/kg）给予相应的药液灌胃，山苓荷甘发醇前后中剂量组大鼠分别按5 mL/kg（相当于给药量10 g/kg）给予相应的药液灌胃，辛伐他汀阳性对照组大鼠灌胃量为5 mg/kg，空白对照组按5 mL/kg剂量给予生理盐水。

2.3 造模与给药 大鼠常规饲养1周，禁食12 h，眼眶采血2 mL，检测基础血脂，造模前各组大鼠血脂比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。1周后开始高脂饲料（78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉和10%猪油、0.2%胆盐）造模，自正式实验开始，除空白对照组喂基础饲料，其余各组大鼠换用高脂饲料喂养10 d，禁食12 h，眼眶采血2 mL，测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、葡萄糖（GLU）。与喂饲高脂饲料前比较，TC、TG、GLU显著升高（P<0.05），可确定已形成高脂血症模型。造模第11天开始大鼠灌胃，连续给药30 d，各组大鼠均自由饮水和进食。空白对照组大鼠给药期间喂基础饲料，其余各组大鼠给药期间继续喂高脂饲料。

2.4 观察指标 末次给药后禁食12 h以上，麻醉后从腹主动脉取血，放置2 h，凝固后3 000 r/min离心15 min。血样离心后取上层血清，按照试剂盒说明书采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA），往预先包被TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU抗体的包被微孔中依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），代入各项指标的标准曲线回归方程中计算各项指标的浓度。

2.5 统计学方法 采用SPSS 22.0分析数据，各组每只大鼠每项指标所有数据先通过狄克松法（Dixson）、格拉布斯法（Grubbs）、指数分布样本法及专业知识进行异常值检验，舍去异常值，再进行正态性检验（Shapiro—Wilk），皆满足正态性（P＞0.05），采用完全随机单因素试验方差分析及LSD法进行两两比较。

3 结果

（1）血清TC：高脂血症模型组大鼠血清TC与空白对照组比较，差异无统计意义（P＞0.05），表明造模不成功，实验误差太大，导致结果异常。

（2）血清TG：山苓荷甘发酵前中、低剂量组，山苓荷甘发酵后中、低剂量组，高脂血症模型组，以及辛伐他汀阳性对照组大鼠血清TG均高于空白对照组（P＜0.05），表明造模成功；山苓荷甘发酵前中、低剂量组，山苓荷甘发酵后中、低剂量组，以及辛伐他汀阳性对照组大鼠血清TG与高脂血症模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明辛伐他汀，发酵前中、低剂量山苓荷甘酵素，以及发酵后中、低剂量山苓荷甘酵素均无降低TG的药效。

（3）血清HDL-L：高脂血症模型组大鼠血清HDL-L与空白对照组比较，差异无统计意义（P＞0.05），表明造模不成功，实验误差太大，导致结果异常。

（4）血清LDL-C：高脂血症模型组大鼠血清LDL-C高于空白对照组（P＜0.05），表明造模成功；山苓荷甘发酵后中剂量组、辛伐他汀阳性对照组大鼠血清LDL-C均低于高脂血症模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明发酵后中剂量山苓荷甘酵素、辛伐他汀均可有效地降低高脂血症大鼠血清LDL-C；而其他各组大鼠血清LDL-C与模型组比较，差异均无统计意义（P＞0.05），表明无降低LDL-C作用。

（5）GLU：高脂血症模型组大鼠血清GLU高于空白对照组（P＜0.05），表明造模成功；山苓荷甘发酵前中、低剂量组，山苓荷甘发酵后中、低剂量组，以及辛伐他汀阳性对照组大鼠血清GLU均低于高脂血症模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；山苓荷甘发酵前中、低剂量组，山苓荷甘发酵后中、低剂量组，以及辛伐他汀阳性对照组大鼠血清GLU与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明辛伐他汀，发酵前中、低剂量山苓荷甘酵素，以及发酵后中、低剂量山苓荷甘酵素均有降低GLU的药效，且能降低大鼠血清GLU至空白对照组水平。（见表1）

表1 各组大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU 比较（，ng/L）

表1 各组大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU 比较（，ng/L）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与高脂血症模型组比较bP＜0.05

4 讨论

本实验结果表明，山苓荷甘发酵后中剂量组和辛伐他汀阳性对照组有降低LDL-C的作用，即具有降血脂作用；辛伐他汀阳性对照组，山苓荷甘发酵前低、中剂量组，以及山苓荷甘发酵后低、中剂量组均有降低GLU的作用，即这5组皆具有降低血糖的作用。

本实验方法系参照国家食品药品监督管理局2014年下发的保健食品9个功能检验方法中附件6辅助降血脂功能评价方法，“用含有胆固醇、蔗糖、猪油、胆酸钠的饲料喂养动物可形成脂代谢紊乱动物模型，再给予动物受试样品，可检测受试样品对高脂血症的影响，并可判定受试样品对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响”。

TC测定数据中空白对照组与高脂血症模型组比较，差异无统计意义（P＞0.05），表明造模不成功，实验误差太大，导致结果异常，故本实验相当于探索性的预实验。本实验结果表明山苓荷甘发酵后的降血脂作用优于不发酵，发酵工序不可缺少，下一步按保健食品研究与开发进行功能试验时，必须在第三方认证机构进行实验，以减少操作误差。