淫羊藿生物碱对环磷酰胺引起的雄鼠生殖系统损伤的保护作用

丁 越，徐晓宇，王亚非，高岩磊，沈明浩,*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130000；2.通标标准技术服务有限公司大连分公司，辽宁大连 116601）

环磷酰胺作为抗肿瘤药物，已在抗癌化疗中得到了广泛应用。此外，环磷酰胺也可以作为免疫抑制剂，治疗机体免疫疾病。但这类化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时具有细胞毒性作用，可以使男性睾丸生精能力受到不同程度的损害甚至导致不育[1]，目前认为，环磷酰胺导致睾丸受损伤的主要机制是由于患者睾丸氧化与抗氧化平衡被破坏，过氧化物质损伤睾丸细胞、DNA，损伤导致的生殖功能受损[2−4]。对于环磷酰胺对生殖系统的损伤引起了大家的广泛关注。寻找天然植物中安全无副作用的活性成分来预防和改善由药物导致的生殖系统损伤已成为了当前的研究热点。

淫羊藿（Epimedium），多年生宿根性草本植物，在我国有多年的药用历史。近年来研究表明淫羊藿中存在多种活性物质[5−6]，具有抗氧化、镇静、增强免功能、保护生殖系统等生理活性[7−11]，而国家卫生部将淫羊藿作为补益药物以来，淫羊藿在保健品中得到了广泛的应用，现已开发出了淫羊藿复合胶囊、劲酒等。淫羊藿主要的生理活性之一是对生殖系统的保护作用。已有报道，淫羊藿提取物可以提升精子的能量代谢水平、提高受损伤小鼠精子质量、精子密度和精子活率、改善受损伤小鼠睾丸组织的病变[12−14]。研究表明，多种生物碱类物质已被证实可以有效保护药物导致的小鼠生殖系统损伤[13,15]，但由于部分生物碱具有较强生物毒性，没有得到广泛应用。近年来对淫羊藿生物碱保护生殖系统作用的研究还处于空白阶段。尤其是对环磷酰胺所致小鼠生殖系统损伤的保护机制的研究还未见报道。

本研究在探讨淫羊藿生物碱是否具有生殖毒性的基础上，深入研究淫羊藿生物碱对环磷酰胺所致小鼠生殖系统损伤的保护机制。此研究为探索淫羊藿资源新的生理活性提供了科学思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

选取SPF 级雄性昆明种8 周龄小鼠80 只（体质量 18～20 g） 辽宁长生生物技术有限公司（许可证号SCXK（辽）2020-0001）；淫羊藿叶 采摘于吉林省通化地区，经吉林农业大学食品科学与工程学院李大军教授鉴定为朝鲜淫羊藿；环磷酰胺 上海萌桠生物科技有限公司；伊红 天津市光复化工研究所；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、睾酮、蛋白定量试剂盒 南京建成生物工程研究所。

XPR-205 电子分析天平 梅特勒-超越系列；HWS-1200CO2培养箱 南京天翔公司；FB-1B-80冻干机 上海争巧科学仪器有限公司；FW-1200 电泳仪、电泳槽 北京六一仪器厂；Varioskan-LUX 全自动酶标仪、KN-01 多功能凝胶成像分析仪 康恒仪器有限公司；KL-01A 离心机 江苏凯达公司；VK-X 光学显微镜 基恩士公司。

1.2 实验方法

1.2.1 淫羊藿生物碱的制备 参照张龙[2]对淫羊藿生物碱的提取的方法，并在此基础上结合超声法对提取条件进行优化。准确称取10.0 g 淫羊藿叶粉末，然后加入 300 mL pH=1 的体积分数90%的乙醇溶液浸泡20 min，抽滤获得滤液，然后于超声清洗仪器在超声功率为200 W，温度40 ℃，提取40 min，抽滤，弃滤渣合并滤液，滤液减压回收乙醇得到酸水液10 mL，重复3 次，取酸水层加入100 mL 10%的NaOH调节pH 至10～11，分装于50 mL离心管中，在 5 ℃，6000 r/min 的条件下离心10 min 得沉淀，用10%NaOH的溶液洗涤并离心三次，弃上清液，加入pH1 的90%酸性乙醇溶液20 mL，超声溶解后经氯仿萃取后抽滤得上清液。冷冻干燥，得粗生物碱，提取得到生物碱得率为9.72%，用三氯甲烷硅胶柱层析法纯化后[16]，纯度为71.52%，以此条件制得的生物碱用于后续研究。

1.2.2 动物分组及给药 首先取40 只SPF 级昆明种雄性小鼠（动物饲养温度22 ～25 ℃、湿度50%～60%，光照/黑各12 h），根据韦贤等[13]实验方法确定小鼠给药剂量和分组情况。小鼠分为空白组、淫羊藿生物碱低（50 mg/kg）、中（100 mg/kg）、高（200 mg/kg）剂量组，每组10 只；再取40 只昆明种雄性小鼠，分为环磷酰胺组（40 mg/kg）、环磷酰胺-生物碱低、中、高剂量组，每组10 只。处理方法如下：空白组（与之前分组共用一组空白组）、淫羊藿生物碱低、中、高剂量组连续5 d 注射生理盐水，末次注射24 h 后，生物碱低、中、高剂量组进行灌胃给药30 d，空白组灌胃同等体积生理盐水。环磷酰胺组与环磷酰胺-生物碱低、中、高剂量组连续5 d 注射环磷酰胺。末次注射24 h 后，环磷酰胺-生物碱低、中、高剂量组灌胃给药生物碱30 d，环磷酰胺组灌胃同等体积生理盐水。

1.2.3 小鼠体重、睾丸和附睾系数的测定 实验期间，每周对各组小鼠称重记录。第30 d，处死各组小鼠，分离附睾和睾丸并称重，计算其睾丸、附睾系数。

1.2.4 小鼠精子质量的测定

1.2.4.1 小鼠精子密度的测定 取小鼠双侧附睾，放入培养皿中，加入 2 mL 0.9%生理盐水，在培养皿中挑破附睾并轻轻挤压，使精子游离在生理盐水中。将附睾取出丢弃。将培养皿置于37 ℃的培养箱中孵育5 min 制成精子悬液，用移液枪取20 μL 精子悬液滴于血细胞计数板上，在光学显微镜下观察并用白细胞计数法进行精子计数[16]（精子密度）。

1.2.4.2 小鼠精子活力的测定 取1.2.4.1 的精子悬液20 μL 滴于血细胞计数板上。在光学显微镜下观察200 个精子，计算小鼠精子活力。精子活力可分为4 个等级：1 级：精子快速直线运动。2 级：精子波浪性或慢速直线运动。3 级：精子运动方向不明确，呈徘徊或转圈运动。4 级：精子没有运动状态。通过各级精子的数量考察精子活力[13]。

1.2.4.3 小鼠精子存活率的测定 取1.2.4.1 的精子悬液20 μL，滴于载玻片上，推片使其均匀，置于甲醇染缸中固定5 min，取出晾干后，放入含有2.5%伊红的染缸中进行染色10 min，染色完毕后，染色剂冲洗干净后晾干置于光学显微镜下观察精子着色情况。染为红色的精子为死亡精子，不着色的精子为活精子。随机选取载玻片的一个区域，计算500 个精子的存活率。

1.2.4.4 小鼠精子畸形率的测定 用1.2.4.3 的方法重新制片染色观察500 个精子，记录畸形精子的数量计算小鼠精子畸形率。其中无头、无尾、双头、双尾、香蕉型、无定型精子记为畸形精子。

1.2.5 小鼠睾丸组织中SOD 活力和MDA 含量的测定 取各组小鼠睾丸，研磨成10%的组织匀浆。倒入10 mL 的EP 管中，在4 ℃ 3000 r/min 的离心机中离心10 min，取上清。根据试剂盒说明测定小鼠睾丸组织中SOD 活力和MDA 含量。

1.2.6 小鼠血清中睾酮的测定 对各组小鼠进行眼球取血放入2 mL 的EP 管中。在4 ℃ 3000 r/min的离心机中离心10 min，取上清。根据试剂盒说明测定小鼠血清中睾酮含量。

1.2.7 小鼠睾丸组织中Bax 和Bcl-2 蛋白表达的检测 取睾丸组织，按照1:5 的体积加入RIPA 裂解液，使用组织研磨仪将睾丸研碎并置于冰上继续裂解30 min，于4 ℃ 5000 r/min 离心10 min，取其上清，参照Braford 法[17]检测睾丸中Bax 和Bcl-2 的蛋白浓度。上清液按照1:5 的比例加入缓冲液，在沸水浴中煮10 min 使蛋白变性。每个孔加入20 μL蛋白质，进行SDS-PAGE 电泳。电泳结束后使用多功能凝胶成像分析仪进行成像。

1.2.8 小鼠睾丸组织病理学观察 取小鼠单侧睾丸，制作石蜡切片，HE 染色后在光学显微镜下观察小鼠睾丸组织病理变化。

1.3 数据处理

各项数据均采用SPSS17.0 软件进行统计分析，各组数据均以±SD（平均值±标准差）表示，多组数据进行比较分析时均采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 淫羊藿生物碱对小鼠体重的影响

实验期间小鼠生长状态良好。体重变化情况见表1，与空白组小鼠比较，生物碱低、中、高剂量组连续灌胃后，各组小鼠体重变化不显著（P>0.05），说明淫羊藿生物碱对小鼠体重没有影响。而环磷酰胺组小鼠体重极显著下降（P<0.01）。与环磷酰胺组比较，环磷酰胺-生物碱低、中、高剂量小鼠体重均维持在正常水平，其中环磷酰胺-生物碱低剂量组与环磷酰胺组比较，体重显著变化（P<0.05），环磷酰胺-生物碱中、高剂量组体重变化极显著（P<0.01）。说明淫羊藿生物碱可以有效缓解由环磷酰胺导致的小鼠体重下降。

表1 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠体重的影响（g）Table 1 Effects of Epimedium alkaloids on weight of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide（g）

2.2 淫羊藿生物碱对环磷酰胺致生殖系统损伤睾丸、附睾系数影响

睾丸、附睾系数数变化情况见表2，与空白组小鼠比较，淫羊藿生物碱连续灌胃30 d 的小鼠睾丸系数和附睾系数没有显著变化（P>0.05），说明淫羊藿生物碱对小鼠睾丸和附睾的系数没有影响。而环磷酰胺组小鼠睾丸系数和附睾系数相比于空白组小鼠变化有极显著性差异（P<0.01），小鼠睾丸系数下降了26.9%，小鼠附睾系数下降了25.8%。与环磷酰胺组小鼠比较，环磷酰胺-生物碱低剂量组小鼠连续灌胃30 d 后，睾丸和附睾系数均有显著提高（P<0.05），分别提高15.1%和3.2%。环磷酰胺-生物碱中、高剂量组小鼠连续灌胃30 d 后，睾丸和附睾系数均有显著提高（P<0.05）。睾丸系数分别提高了28.5%、35.0%。附睾系数分别提高了14.7%、25.8%。

表2 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠睾丸、附睾系数的影响（%）Table 2 Effects of Epimedium alkaloids on testicular and epididymis coefficient of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide（%）

2.3 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠精子质量的影响

小鼠精子质量变化情况见表3，与空白组小鼠比较，淫羊藿低、中、高剂量组灌胃后，小鼠精子密度、精子活力、精子存活率、精子畸形率的变化并没有显著性差异（P>0.05），说明淫羊藿生物碱对小鼠精子没有造成损伤。小鼠注射环磷酰胺后，小鼠精子密度、精子活力、精子存活率分别极显著下降了59.8%、31.5%、45.9%（P<0.01），精子畸形率极显著升高了905%（P<0.01）。与环磷酰胺组小鼠比较，环磷酰胺-生物碱低剂量组灌胃后，小鼠精子密度、精子活力、精子存活率分别提高了33.8%、15.4%、26.0%，精子畸形率下降了60.9%（P<0.05），而环磷酰胺-生物碱中、高剂量组灌胃后，小鼠精子密度、精子活力、精子存活率、精子畸形率的变化有极显著性差异（P<0.01）。小鼠精子密度分别提高了59.0%、84.2%，小鼠精子活力分别提高24.6%、37.6%，精子存活率分别提高了34.7%、53.8%，而精子畸形率分别降低了68.4%、71.7%。

表3 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠精子质量的影响Table 3 Effects of Epimedium alkaloid on sperm quality of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

2.4 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠睾丸组织中SOD 活力和MDA 含量的影响

SOD 变化情况由图1 可知，与空白组比较，淫羊藿生物碱低、中、高剂量组灌胃30 d 后，小鼠睾丸组织中SOD 的活性变化没有显著性差异（P>0.05），说明淫羊藿生物碱不会影响小鼠SOD 的活性。小鼠注射环磷酰胺后睾丸组织中SOD 的活性极显著下降40.6%（P<0.01）。与环磷酰胺组小鼠比较，环磷酰胺-生物碱低、中、高组小鼠连续灌胃30 d 后，环磷酰胺-生物碱低剂量组SOD 的活性显著提高12.6%（P<0.05），环磷酰胺-生物碱中、高剂量组小鼠睾丸组织中SOD 的活性极显著提高26.1%、35.4%（P<0.01）。

图1 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠睾丸组织中SOD 活力的影响Fig.1 Effect of Epimedium alkaloid on SOD activity in testis of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

由图2 可知，与空白组比较，淫羊藿生物碱低、中、高剂量组灌胃30 d 后，小鼠睾丸组织中MDA 的含量变化没有显著性差异（P>0.05），说明淫羊藿生物碱不会影响小鼠MDA 的含量。与空白组小鼠比较，小鼠注射环磷酰胺后睾丸组织MDA 的含量极显著升高了57.6%（P<0.01）。与环磷酰胺组比较，环磷酰胺-生物碱低剂量组MDA 的含量显著下降14.3%（P<0.05）、环磷酰胺-生物碱中、高组小鼠MDA 的含量极显著下降29.5%、31.6%（P<0.01）。

图2 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠睾丸组织中MDA 含量的影响Fig.2 Effect of Epimedium alkaloid on MDA activity in testis of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

2.5 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠血清中睾酮含量的影响

由图3 可知，与空白组比较，淫羊藿生物碱低、中、高剂量组灌胃30 d 后，小鼠血清中睾酮的含量变化没有显著性差异（P>0.05），说明淫羊藿生物碱不会影响小鼠血清中睾酮的含量。小鼠注射环磷酰胺后血清中睾酮的含量与空白组比较极显著降低了60.4%（P<0.01）。与环磷酰胺组小鼠比较，环磷酰胺-淫羊藿生物碱低剂量组睾酮含量显著升高24.6%（P<0.05），环磷酰胺-生物碱中、高组小鼠灌胃30 d后小鼠血清中睾酮的含量极显著升高了49.4%、54.4%（P<0.01）。

图3 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠血清中睾酮的影响Fig.3 Effect of Epimedium alkaloid on testosterone in serum of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

2.6 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠睾丸组织中Bax 和Bcl-2 蛋白表达的影响

由图4 可知，与空白对照组比较，淫羊藿生物碱低、中、高剂量组Bcl-2/Bax 的比值无显著差异（P>0.05），说明淫羊藿生物碱不会促进睾丸组织细胞凋亡。与空白对照组比较，环磷酰胺组Bcl-2/Bax 的比值极显著下降（P<0.01），该结果说明环磷酰胺会促进睾丸组织的凋亡，导致生精细胞凋亡。与环磷酰胺组小鼠相比较，环磷酰胺-淫羊藿生物碱低剂量组，Bcl-2/Bax 的比值有显著提高（P<0.05），环磷酰胺-淫羊藿生物碱中、高剂量组小鼠Bcl-2/Bax 的比值有极显著提高（P<0.01）。

图4 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠睾丸组织中Bax 和Bcl-2 蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Epimedium alkaloid on expression of Bax and Bcl-2 proteins in testicular tissue of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

2.7 淫羊藿生物碱对环磷酰胺生殖系统损伤小鼠睾丸组织病理学观察

通过对小鼠睾丸组织切片观察，空白组小鼠睾丸组织中生精细胞排列整齐数量众多，并且形态完整，睾丸间质细胞管腔内充满众多的新生精子（图5A）。小鼠连续灌胃淫羊藿生物碱低、中、高剂量30 d 后，睾丸组织形态与空白组相似，无明显病理学变化（图5B、C、D）。通过切片观察，环磷酰胺组小鼠睾丸组织中生精细胞数量减少，管腔内几乎没有新生精子，睾丸组织受到严重损伤（图5E）。与环磷酰胺组小鼠比较，环磷酰胺-生物碱低剂量组的小鼠睾丸组织中生精细胞和管腔内新生精子的数量有所增加（图5F）。环磷酰胺-生物碱中剂量组的小鼠生精细胞数量更多，管腔内新生精子的数量也有少量增加，睾丸间质细胞的数量也有明显增加（图5G）。环磷酰胺-生物碱高剂量组小鼠睾丸组织中间质细胞更加完整，生精细胞与管腔内新生精子数量也明显增加（图5H）。

图5 小鼠睾丸形态学分析Fig.5 Morphological analysis of mouse testis

3 讨论与结论

生殖系统对化学毒物的作用十分敏感，在其他系统还未出现毒性反应之前，生殖系统可能已受损害[18]。环磷酰胺能够损伤小鼠精子质量，使精子活力下降，睾丸结构发生病变[19]。精子质量及活力可反映该药物的生殖毒性和对生殖细胞潜在的致突变性。环磷酰胺在造成生精损伤的同时，也可破坏睾丸组织内氧化与抗氧化的平衡系统，降低睾丸组织的抗氧化能力，导致氧自由基及其过氧化物质在机体内大量累积，从而造成睾丸组织氧化应激损伤。SOD 能清除超氧阴离子自由基，可以保护细胞免受自由基的攻击，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用[10]。MDA 可分解由自由基攻击机体生物膜而产生的脂质过氧化产物，是常用的评定机体氧化损伤的指标[20]。MDA 水平可间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。因此，联合检测组织中SOD、MDA 含量，能确切地反映组织抗氧化能力和氧化应激损伤程度[17]。

本研究结果表明，淫羊藿生物碱对雄性小鼠的生殖系统无生殖毒性作用。利用环磷酰胺造模后发现，环磷酰胺可致睾丸、附睾质量减轻、精子密度降低、精子畸形率升高、睾丸组织抗氧化酶SOD 的含量下降，过氧化产物MDA 含量明显升高，说明环磷酰胺成功造成小鼠生精损伤及睾丸组织氧化应激损伤，这与潘晓燕等[21]的实验结果相一致。给予淫羊藿生物碱可使小鼠精子密度、活力和存活率显著提高（P<0.05）、精子畸形率显著下降（P<0.05），说明淫羊藿生物碱可以改善模型小鼠的生精损伤，且当给予由环磷酰胺导致的生殖系统损伤小鼠一定剂量的淫羊藿生物碱后，睾丸组织内抗氧化能力明显升高，组织损伤得到了修复。说明淫羊藿生物碱在一定程度上可通过缓解氧化损伤来保护生殖系统，进而对环磷酰胺引起的雄性生殖系统损伤起到了保护作用。此外，本研究还发现淫羊藿生物碱可提高小鼠血清中睾酮的含量。在哺乳动物中睾酮的含量与精子的生成密不可分[21−23]。睾酮的合成量直接关系到精子的数量和质量，所以说睾酮含量的高低是保证精液品质的重要因素[24−26]。环磷酰胺注射后小鼠血清睾酮含量降低，而通过淫羊藿生物碱进行灌胃后的小鼠睾酮含量明显升高，进而提高了雄性小鼠的生殖功能，对生殖系统起到了一定的保护作用[27−28]。最后，考察了生物碱对抑制睾丸组织细胞凋亡的影响。精子凋亡蛋白是判断精子质量的重要指标。Bcl-2 是凋亡抑制蛋白，Bax 是促细胞凋亡蛋白，Bcl-2/Bax 的比值可以反映灌胃淫羊藿生物碱后细胞接收到凋亡信号后是趋向于凋亡或存活情况。环磷酰胺注射后小鼠睾丸组织中Bcl-2/Bax 的比值降低，淫羊藿生物碱进行灌胃后，Bcl-2/Bax 的比值极显著升高，促进了Bcl-2 表达，抑制了Bax 表达，睾丸细胞趋于存活状态，进而缓解了环磷酰胺对睾丸组织造成的损伤。

综上所述，淫羊藿生物碱无雄性生殖毒性，且淫羊藿生物碱可通过抗氧化、升高睾酮含量、抑制睾丸组织细胞凋亡等机制，有效保护了由环磷酰胺导致的雄性小鼠生殖系统的损伤，可作为保护生殖系统的保健品原料进行开发和推广。