“落别”樱桃果实不同发育期糖酸组分积累及软化相关成分研究

齐 勇，韩秀梅，宋 莎，冯建文，张 敏，吴亚维

（贵州省果树科学研究所，贵州贵阳 550006）

“落别”樱桃是贵州省六盘水市六枝特区地方中国樱桃（Cerasus pseudocerasusLindl.）品种。中国樱桃属于蔷薇科李亚科樱属，因表皮鲜红、汁多味甜、粒大、肉厚核小，一直深受消费者的喜爱[1−2]。樱桃果实发育过程中会积累大量的可溶性糖、有机酸及挥发性物质，三者的组分及含量决定果实的品质和风味[3]。果实中的糖和有机酸是合成维生素和氨基酸等营养成分的基础物质，在果实的呼吸、光合作用以及酯类、酚类和氨基酸的合成中发挥重要作用[4]，能够为果树的生长发育提供能量和代谢中间产物，也是果树基因表达过程中的重要调节因子[5]。

果实中有机酸组分很多，但大多数果实通常以1 种或2 种有机酸为主，其它仅以少量或微量存在。目前，已有研究表明中国樱桃果实中有机酸以苹果酸为主，甜樱桃果实糖组分主要为葡萄糖和果糖，蔗糖含量较低，不积累淀粉和山梨醇[6]。糖类是果实的重要构成物质，并且糖酸代谢与果实的后熟软化存在明显的相关性[7−8]。在果实后熟软化过程中，淀粉水解酶包括α-淀粉酶和β-淀粉酶能够随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖[9]。果实质地是影响果实品质的重要指标，质地变软是大多数果实从成熟到衰老的必然生理过程，也是采后生理研究的重要领域，中国樱桃采后迅速软化是导致其不耐贮藏的主要原因之一[10−12]。中国樱桃属于非呼吸跃变型（non-climacteric fruits），该类果实的呼吸特征是呼吸强度低，无明显后熟现象和呼吸上升现象[13]。相关研究发现核果类果实软化主要是由中果皮薄壁细胞结构发生变化所引起[14]。果实软化与细胞结构变化密切相关，细胞结构主要依靠细胞壁的支持，细胞壁物质发生降解，导致细胞胞间层结构改变，从而导致果实软化[15−16]。胞间层由果胶多聚物构成，果胶由原果胶、果胶酸甲酯和果胶酸组成。伴随着成熟软化，原果胶降解为水溶性果胶，细胞结构随之受损，水溶性果胶含量大幅上升，这在桃、草莓、甜樱桃等果实软化中均有所发现[17−19]。果胶物质发生降解，导致细胞间粘合力的下降主要是由果胶酶所引起的[20]。多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶裂解酶（PL）是研究最为广泛的两种细胞壁降解酶。多聚半乳糖醛酸酶能催化果胶分子中α-1,4-聚半乳糖醛酸的裂解，将多聚半乳糖醛酸降解为寡聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸[21]，导致果胶发生降解。果胶裂解酶能够催化裂解去醋化的多聚半乳糖醛酸上第5 位的β-碳原子，导致α-1,4-糖苷键断裂，造成细胞结构的破坏，进而导致果胶的降解[22]。

近年来，核果类果实的软化机理研究大多侧重于采后生理及贮藏方面，而本实验更加注重果实品质形成，尤其是果实发育过程中糖酸积累及氨基酸变化，同时对果实发育过程中细胞壁物质降解有关的多种酶的变化进行研究，以期系统、深入地研究“落别”樱桃果实发育过程中糖酸积累特点和果实软化因素，为“落别”樱桃品种选育、提高果实品质和采后贮藏品质等方面提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试材料 为贵州省六盘水市六枝特区地方品种“落别”樱桃，采样植株9 年生，位于六枝特区落别乡抵耳村，选择15 株生长势比较一致的植株作为试验株；壬酸甲酯、核糖醇 均为分析纯，购自贵州省格瑞恩科技有限公司；直链淀粉、支链淀粉、原果胶、可溶性果胶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶等试剂盒 苏州科铭生物技术有限公司；甲醇、甲基叔丁基醚 均为色谱纯，苏州科铭生物技术有限公司。

DW-HL678 型超低温冰箱 成都川弘科生物技术有限公司；Lyolab3000 冷冻干燥仪 深圳市鸿铭生物科技有限公司；YG16W 型台式高速冷冻离心机四川蜀科仪器有限公司；移液枪 德国艾本德公司；DK-98-II 型双列八孔电热恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司；BSA224S 万分之一天平 上海菲恰尔分析仪器有限公司；Multiskan FC 全自动酶标仪、QP 2010Plus 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）美国赛默飞世尔公司。

1.2 实验方法

1.2.1 取样方法 分别在果实坐稳膨大前（盛花后32 d）、膨大期（盛花后40 d）、转色期（盛花后45 d）、成熟期（盛花后50 d）取样，在实验植株树冠中部外围结果枝上取样，每5 株作为一个重复，三个重复共计15 株，每株随机采摘成熟度一致的果实30 颗，去掉种子后液氮速冻，然后于−80 ℃保存待检测，样品检测前冷冻干燥。

1.2.2 可溶性糖、有机酸和氨基酸含量的测定 参照Sheng 等[23]的方法，将−80 ℃保存样品通过冷冻干燥机进行冷冻干燥，准确称取果肉干样0.1 g，液氮中充分研磨成粉，用2.7 mL 甲醇萃取，再加入 300 μL 0.2 mg/mL 核糖醇（内标），剧烈振摇超声处理 30 min后，将混合物放入恒温水浴锅中。70 ℃水浴15 min，5000 g 离心15 min，取100 μL 上清液进行真空浓缩。参考Zhao 等[24]的方法进行衍生代谢物分析，通过 GC-MS 分析样品，得到总离子流谱图，应用色谱峰面积归一法测定各组分的相对含量。

1.2.3 淀粉和果胶含量及相关酶活性测定

1.2.3.1 直链淀粉、支链淀粉含量测定 直链淀粉和支链淀粉含量测定按照直链淀粉试剂盒和支链淀粉试剂盒操作步骤进行。准确称取果肉干样0.1 g，液氮中充分研磨成粉，加入 1 mL 试剂一，充分匀浆后转移到 EP 管中，80 ℃水浴提取30 min，25 ℃离心5 min，弃上清，留沉淀，加入 1 mL 试剂二（乙醚）振荡5 min，25 ℃离心 5min，弃上清，留沉淀，加入 1 mL试剂三充分溶解，90 ℃水浴 10 min，冷却后利用酶标仪进行测定。

1.2.3.2 原果胶、可溶性果胶含量测定 原果胶含量通过微量法100T/48S 测定。准确称取果肉干样0.1 g，按照样品质量（g）和提取液一体积（mL）为 1:20 的比例，置于 90 ℃恒温水浴锅中浸提 30 min，取出冷却后于 5000 g、25 ℃离心10 min，去掉上清，沉淀中再加入1 mL 提取液一重复操作一次，离心后去上清，沉淀中加入 1 mL 提取液二，置于 90 ℃恒温水浴锅中水解 1 h，取出冷却后于 8000 g 25 ℃离心15 min，取上清液待测，按照原果胶试剂盒操作步骤进行。

可溶性果胶含量通过酶标法测定，取约 0.3 g 样本，加入 1 mL 80%乙醇，室温快速匀浆，95 ℃水浴20 min，冷却至室温，4000 g 25 ℃离心 10 min，弃上清。沉淀加入 1.5 mL 80%乙醇和丙酮各洗一遍（涡旋振荡 2 min 左右，4000 g 25 ℃离心 10 min，弃上清即可），沉淀即为粗细胞壁，加入 1mL 试剂一（去除淀粉）浸泡 15 h，4000 g 25 ℃离心 10 min，弃上清，将沉淀干燥，称重得细胞壁物质（CWM）。称取烘干的 CWM 3 mg，加入 1 mL 试剂二，充分匀浆。8000 g 4 ℃离心10 min，取上清液待测，按照可溶性果胶试剂盒操作步骤进行。

1.2.3.3α-淀粉酶、β-淀粉酶含量测定 称取 0.1 g样本，加 1 mL 蒸馏水匀浆；将匀浆倒入离心管中，在室温下放置提取 15 min，每隔 5 min 振荡 1 次，使其充分提取；3000 g，25 ℃离心 10 min，吸取上清液并且加蒸馏水定容至 10 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液 1 mL，加入 4 mL 蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α＋β）淀粉酶总活力的测定。α-淀粉酶（α-amylase，α-AL）和β-淀粉酶（βamylase，β-AL）通过酶标法测定，按照α-淀粉酶试剂盒和β-淀粉酶试剂盒操作步骤进行。

1.2.3.4 多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶含量测定准确称取果肉干样0.1 g，液氮中充分研磨成粉，按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:10 的比例，进行冰浴匀浆。16000 g 4 ℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。多聚半乳糖醛酸酶（ploygalacturonase, PG）活性测定按照多聚半乳糖醛酸酶试剂盒进行。

准确称取果肉干样0.1 g，液氮中充分研磨成粉，按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:10 的比例，进行冰浴匀浆。10000 g，4 ℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。果胶裂解酶（pectinatelyases，PL）活性测定按照多聚半乳糖醛酸酶试剂盒和果胶裂解酶试剂盒说明书操作测定。

1.3 挥发性物质成分测定

参考Zhang 等[25]的方法检测樱桃果树挥发性物质，称取0.2 g 样品置于2 mL 离心管中，加入500 μL超纯水后涡旋混匀，再添加500 μL 壬酸甲酯的MTBE 后涡旋混匀，混合液置于超声中40 ℃条件下超声萃取1 h，然后在4 ℃ 12000 g 离心l0 min，用1 mL 注射器吸取上清液用0.22 μm 滤膜过滤进2 mL进样瓶中，待测。利用气相色谱-质谱联用仪（GCMS）QP 2010Plus 分析检测到的挥发性化合物质谱图经计算机检索并与 NIST14 质谱库进行匹配检索分析，结合保留时间和匹配度以及相关文献进行谱图解析，对检出物质各组分进行分析。

1.4 数据处理

数据统计分析使用 SPSS 16.0 软件处理，应用最小显著性差异法（LSD） 进行单因素方差分析，Duncan 多重对比分析，显著性水平为P<0.05，使用Excel 2007 软件作图。

2 结果与分析

2.1 樱桃果实不同发育时期可溶性糖组分及含量变化

由图1 可知，“落别”樱桃果实发育不同时期可溶性糖主要包含果糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、β-D-别吡喃糖、山梨糖醇以及肌醇。果糖和葡萄糖是2 种主要糖组分，占总糖含量的79.17%～88.23%（图1A、B、H），其次是山梨糖醇和蔗糖，分别占总糖含量的9.52%和4.68%（图1E、G、H）。果糖、葡萄糖和山梨糖醇在“落别”樱桃四个发育时期含量呈S 型曲线升高，尤其是在果实膨大期到转色期含量显著增加（P<0.05）。其中，果糖在稳果期、膨大期、转色期和成熟期含量分别为85.80、107.30、355.33 mg/g 和433.83 mg/g，占可溶性糖总量的38.97%、38.14%、51.21%和52.41%；葡萄糖在稳果期、膨大期、转色期和成熟期含量达到87.76、119.77、256.91 mg/g和295.20 mg/g，分别占可溶性糖总量的40.20%、42.58%、37.02%和35.66%。蔗糖含量在稳果期和膨大期含量变化不显著（P>0.05），分别为20.79、20.68 mg/g，到转色期含量显著下降（P<0.05），相比稳果期降低了57.77%（图1G）。β-D-别吡喃糖在果实成熟期含量最高，为14.81 mg/g（图1D）。木糖和肌醇含量较低，在果实膨大期含量达到最高，分别为2.86 mg/g 和2.48 mg/g，显著高于其他三个发育时期（图1C、F）（P<0.05）。

图1 樱桃果实不同发育时期可溶性糖含量变化Fig.1 Changes in the soluble sugar content of cherry fruits at different developmental stages

2.2 樱桃果实不同发育时期有机酸组分及含量变化

图2 可知，“落别”樱桃果实有机酸的种类很多，随着果实发育时期的进行，总体呈降低的趋势。其中，苹果酸含量最高，在稳果期、膨大期、转色期和成熟期含量逐渐降低，分别为201.87、160.14、177.43 mg/g 和109.53 mg/g，占总酸含量的98%以上，为典型的苹果酸型水果。奎宁酸和草酸的变化趋势一致，先升高后降低，在膨大期达到最高值，分别为0.49 mg/g 和0.19 mg/g。琥珀酸、氨基丁酸和草酸含量最低，四个发育时期无显著性变化（P>0.05）。柠檬酸和延胡索酸在稳果期含量最高，为0.71 mg/g和0.18 mg/g，随着果实的发育显著降低（P<0.05），在成熟期完全降解。

图2 樱桃果实不同发育时期有机酸含量变化Fig.2 Changes in the content of organic acids in cherry fruits at different developmental stages

2.3 樱桃果实不同发育时期氨基酸组成及含量

由表1 可知，“落别”樱桃果实中共鉴定出7 种氨基酸，其中人体必需氨基酸2 种，非必需氨基酸5 种；药用氨基酸、鲜味氨基酸和甜味氨基酸各2 种。氨基酸组分中含量最高的是谷氨酸，在稳果期和膨大期分别达到0.533 mg/g 和0.459 mg/g，占氨基酸的37.64%和40.19%。其次是天门冬氨酸，在稳果期和膨大期分别达到0.444 mg/g 和0.173 mg/g，占氨基酸的31.36%和15.15%。丙氨酸在果实膨大期含量最高，达到0.204 mg/g，显著高于其他三个发育时期（P<0.05）。在果实四个发育时期中，氨基酸种类和含量随着果实发育不断减少，在转色期和成熟期仅存在苏氨酸和丙氨酸2 种氨基酸。总氨基酸含量显著性降低（P<0.05），成熟期总氨基酸含量相比稳果期降低了91.67%。

表1 樱桃果实不同发育时期氨基酸组成及含量Table 1 Amino acid composition and content of cherry fruits at different developmental stages

2.4 樱桃果实发育过程中淀粉和果胶组分及相关酶活性分析

由图3A、B 可知，在“落别”樱桃果实发育过程中原果胶含量和可溶性果胶含量呈负相关。随着果实的发育原果胶含量呈显著下降趋势(P<0.05)，分别为17.35、13.84、11.79、8.99 mg/g FW。与此相反，可溶性果胶含量在果实的稳果期、膨大期和转色期则显著升高(P<0.05)，在果实转色期含量达到35.18 mg/g DW，相比膨大期，转色期含量升高了88.48%。果胶裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶活性变化一致，在果实发育过程中都先升高后逐渐降低。果胶裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶活性在果实膨大期达到最高值，分别为66.96、60.90 U/mg，而后在转色期活性发生显著降低(P<0.05)，相比膨大期降低了77.81%、57.78%。在果实发育的4 个时期，直链淀粉和支链淀粉含量总体呈下降趋势，其中，支链淀粉含量显著高于直链淀粉（P<0.05）。支链淀粉含量由稳果期的80.76 mg/g DW 下降到成熟期的40.57 mg/g DW，直链淀粉含量由19.12 mg/g DW 下降到11.67 mg/g DW。α淀粉酶和β淀粉酶活性呈先升高再降低的趋势，在果实膨大期达到最高，分别为0.13 U/mg 和0.83 U/mg，在果实成熟期含量降到最低，为0.02 U/mg 和0.12 U/mg。α淀粉酶和β淀粉酶在果实膨大期的快速升高，使得淀粉含量逐渐降低，说明α淀粉酶和β淀粉酶对淀粉的分解有一定促进作用。

图3 樱桃果实不同发育时期果胶和淀粉组分含量及相关酶活性变化Fig.3 Changes of pectin and starch components and related enzyme activities in different developmental stages of cherry fruit

2.5 樱桃果实发育过程中香气成分的分析

由图4 可知，从“落别”樱桃果实发育各时期共检测到6 种芳香物质分别为3-己醛、（E）-2-己醛、3-己烯-1-醇、（E）-2-己烯-1-醇、2-己醛和苯甲醛。其中，醛类化合物是樱桃果实香气成分中是最主要的一类物质，主要包括 C6醛类和芳香醛类。C6醛类化合物包括3-己醛、（E）-2-己醛和2-己醛。在果实的不同发育阶段，香味含量存在差异，其中含量较丰富的为3-己醛。在稳果期，樱桃果实3-己醛丰富度最高，随着果实发育时期的进行丰富度不断降低。壬酸甲酯在果实膨大期丰富度达到最高。芳香醛类化合物苯甲醛在果实转色期丰富度达到最高，在稳果期最低。

图4 樱桃果实不同发育时期香气成分热图Fig.4 Heat map of aroma components of cherry fruits at different developmental stages

3 讨论

樱桃果实中可溶性糖、有机酸、氨基酸及挥发性香气组分及含量是决定果实风味和品质的重要因子，作为一种非呼吸跃变型水果，樱桃果实在其发育过程中会发生一系列的变化，而这种动态变化是果实品质形成的重要基础[26−28]。本文对供试品种“落别”樱桃可溶性糖、有机酸、氨基酸和香气物质成分进行分析，从生理水平揭示“落别”樱桃果实风味的形成，发现“落别”樱桃果实发育不同时期糖分积累以葡萄糖和果糖两种还原糖为主，占总糖含量的80%以上，属于典型的己糖积累型，与李航[29]在中国樱桃上的研究结果一致。

在“落别”樱桃果实4 个发育期，葡萄糖和果糖含量最高，且随着发育时期的进行含量显著升高。果实风味取决于糖酸组分、含量和比例[30]。按照成熟果实中所积累的主要有机酸种类，大体可将果实分为苹果酸型、柠檬酸型和酒石酸型三种类型。果实中的有机酸有许多种，但大多以1 种或2 种为主，其它以少量或微量存在。杏[31]和桃[32]果实中的有机酸主要为柠檬酸和苹果酸，葡萄[33]和荔枝[34]果实中的有机酸主要为苹果酸和酒石酸。“落别”樱桃果实中苹果酸占总酸含量的98%以上，为典型的苹果酸型水果。

对“落别”樱桃果实不同发育时期淀粉含量变化分析发现，果实发育过程中淀粉含量发生显著降低（P<0.05），淀粉酶活性先升高后随着淀粉含量的降低也逐渐下降，这与王婷等[35]在甜樱桃上的研究结果一致。“落别”樱桃成熟快，果实硬度下降迅速，果胶含量的变化与果肉硬度下降密切相关，原果胶和水溶性果胶分别与果肉硬度呈显著正相关和负相关[36]。在本实验中，“落别”樱桃果实中原果胶含量呈显著下降趋势，而可溶性果胶含量在果实的稳果期、膨大期和转色期发生显著升高,与薛炳烨等[37]在桃上的研究结果相似。多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶裂解酶（PL）是参与果胶降解的关键酶活，能够将原果胶分解为可溶性果胶，从而使得果实硬度下降[20]。“落别”樱桃发育过程中，PG 和PL 在稳果期含量低，而在果实膨大期快速升高，从而促进了原果胶分解以及可溶性果胶含量的显著增加。

此外，果实中氨基酸和挥发性物质组分含量也同样影响果实风味和品质。Mattheis 与Girard[10,38]研究认为己醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、苯甲醛是甜樱桃果实最重要的香气成分。本实验通过GC-MS 共检测出6 种主要挥发性物质，包括 C6醛类和芳香醛类。“落别”樱桃果实中C6醛类化合物包括3-己醛、（E）-2-己醛和2-己醛，在不同发育阶段，香味含量存在差异，其中含量较丰富的为3-己醛，随着果实发育时期的进行丰富度不断降低，芳香醛类化合物苯甲醛在果实转色期丰富度达到最高。本文的研究结果也发现己醛是“落别”樱桃主要的挥发性物质，与前人在甜樱桃上的研究结果一致，但具体的己醛类别存在差异，而且检测的挥发性物质比较少，可能是样品差异和检测方法不同所致。氨基酸不仅是果实主要的营养物质，也在果实风味构成中发挥重要作用。天门冬氨酸和谷氨酸是“落别”樱桃果实发育前期主要的氨基酸组分，而这两种氨基酸均属于鲜味类氨基酸，可能在樱桃果实的风味形成中发挥了重要作用。

4 结论

“落别”樱桃果实可溶性糖积累分别以葡萄糖和果糖为主，是典型的己糖积累型果实。果实有机酸以苹果酸为主，柠檬酸和戊二酸含量次之，其中苹果酸质量分数远高于其他有机酸，且发育期内呈逐渐降低的变化趋势。原果胶的分解，使得可溶性果胶含量快速增加，从而导致果实软化。PG、PL 和淀粉水解酶在果实成熟和品质形成中发挥了重要作用。以上研究结果可为“落别”樱桃的品种改良、果实贮藏保鲜和提高果实品质等方面提供一定理论依据。