基于离子迁移谱的花生霉变早期预警标示分子研究

黎家奇，康晓风，李红波，莫海珍，徐 丹，胡梁斌，帅 良，张 浩,*

（1.河南科技学院食品学院，河南新乡 453003；2.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021；3.贺州学院食品与生物工程学院，广西贺州 542899）

花生是非常重要的产油产蛋白质的经济作物[1]，原产于南美洲，广泛种植于中国、非洲、印度、日本、美国等国家[2]。自20 世纪60 年代以来，黄曲霉毒素污染成为全世界花生产业所面临的主要问题。黄曲霉毒素是黄曲霉菌的次生代谢物，会对人类和动物产生严重的毒副作用。受到黄曲霉毒素污染的花生因失去使用和加工性能造成重大的经济损失[3]。花生生产过程中的采前、收获和采后储藏各阶段所存在的多种因素会造成花生中黄曲霉毒素的污染[4]。同时花生对黄曲霉污染的高度敏感性会导致黄曲霉毒素的进一步加剧污染。黄曲霉危害风险的早期识别与预警对于花生等农产品的科学防控和安全保障具有重大作用和意义。

目前黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）等，这些已广泛用于食品和饲料中黄曲霉毒素的检测[5−7]。这些方法往往存在操作步骤复杂、操作时间长、检测灵敏度差等问题[4]，无损快速检测目前尚不可行。随着色谱和光谱技术的不断发展，食品工业中霉菌的鉴定已转向检测，诸如霉菌毒素和霉菌产生的挥发性有机化合物等霉菌生长代谢产物[8]。微生物挥发性有机化合物（VOCs）是指细菌和真菌在生长繁殖过程中产生的初级或次级代谢挥发性化合物。黄曲霉在生长过程中消耗多种营养物质，产生多种代谢产物，释放20 多种影响花生品质和安全性的挥发性有机化合物[9−10]。微生物挥发性有机化合物是广泛应用于临床诊断和环境监测中的微生物生长评价指标，目前逐渐成为研究微生物污染的新型有效手段[11]。气相色谱-离子迁移谱（GCIMS）监测系统是目前研究常用的新型技术，使用该方法检测挥发性有机化合物与电子鼻和气相色谱-质谱（GC-MS）技术相比，具有使用简单、设备便携、灵敏度高、样品无需前处理等优点[9]。目前该技术在食品中的应用主要集中在橄榄油、大米、蜂蜜和茶叶的质量评价上，在花生霉菌检测领域的研究较少[12−14]。

本研究利用气相色谱-离子迁移谱技术对花生中霉菌生长的不同阶段产生的挥发性有机化合物进行了检测和分析。利用特征指纹图谱和热图聚类分析黄曲霉的侵染过程，使用主成分分析结合聚类分析寻找花生早期霉变的标识分子，探究该方法在花生霉变程度快速评估及早期预警中应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄曲霉菌株CGMCC3.2890 中国微生物菌种保藏中心；沙氏培养基（1%蛋白胨、2%琼脂和4%葡萄糖） 深圳子科生物科技有限公司；次氯酸钠 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

FA224 型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；LHR-250-S 恒温恒湿培养箱 韶关市泰宏医疗器械有限公司；Flavour Spec 气相-离子迁移谱风味分析仪 德国G.A.S 公司；FS-SE-54-CB-1 毛细管柱（15 m，内径：0.53 mm） 兰州中科安泰分析科技有限责任公司；CTC-PAL 自动顶空进样装置瑞士CTC Analytics 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生侵染实验 使用沙氏葡萄糖琼脂培养基培养黄曲霉菌株（CGMCC3.2890）。使用0.1%次氯酸钠溶液浸泡花生1 min，无菌水洗涤3 次。然后将花生浸入约106个/mL 黄曲霉孢子悬浮液中10 s，接着置于无菌水琼脂培养基培养皿中，室温下干燥后30 ℃恒温恒湿培养箱培养并观察黄曲霉侵染情况。未经黄曲霉孢子污染的花生样品作为对照组。样品每24 h 采集一次，放置于20 mL 顶空进样瓶储存于−18 ℃冰箱。每个采样时间节点采集三份样品。

1.2.2 气相色谱-离子迁移谱测定 采用气相色谱-离子迁移谱风味分析仪对不同储藏条件下花生中的挥发性化合物进行鉴定及相对定量分析。进样针温度65 ℃，赋予温度60 ℃，温育时间10 min，使用无分流模式解吸法注入样品500 μL[15−17]。使用置于60 ℃的FS-SE-54-CB-1 毛细管柱（15 m，内径：0.53 mm），以氮气为载气进行色谱分离。在等温条件下，使用载气流动色谱分离，载气流速从2 mL/min开始持续2 min，在8 min 内增加到20 mL/min，在10 min 内增加到100 mL/min，在10 min 时增加到150 mL/min。分析过程总计耗时30 min[18]。

1.3 数据分析

使用仪器配套的功能分析软件LAV（Laboratory Analytical Viewer）和配套三款插件以及GC×IMS Library Search 定性软件，分别从不同角度对样品进行分析[19]。使用设备自带的LAV 分析软件中Reporter、Gallery 和Dynamic PCA 插件程序和GC×IMS Library Search 构建挥发性有机物的差异图谱。同时为了，通过软件中内置的NIST 2014 气相保留指数数据库和G.A.S 的IMS 迁移时间数据库对分析样品材料进行二维定性分析[20−22]。同时使用热图和主成分分析进行样本聚类分析[23]。使用R 软件包pheatmap 构建热图，factoextra 构建主成分分析图。

2 结果

2.1 挥发性有机化合物气相色谱-离子迁移谱图

黄曲霉侵染花生过程中会消耗许多营养物质，产生各种代谢产物，形成各种挥发性有机化合物，对花生的品质和安全性造成影响。通过使用气相色谱-离子迁移谱对花生样品中不同生长阶段黄曲霉菌产生的挥发性有机化合物进行差异分析，探究花生中黄曲霉不同侵染阶段的特异挥发性有机化合物[23−24]。

花生样品和黄曲霉侵染不同生长阶段（不同采样时间节点）样品图片和挥发性有机化合物3D 可视化图谱如图1A 所示。实验结果表明P1 组与对照组相比并未观察到明显变化，P2 组侵染样品出现轻微霉变现象，而P3～P5 组出现明显的黄曲霉霉变现象。同时通过观察3D 可视化图谱结果发现长时间的储存导致某些化合物的含量降低，与此同时还观察到新的挥发性有机化合物形成。以上结果表明在霉菌侵染花生期间霉菌可能通过代谢花生自身所产生的挥发性有机化合物或有机物质产生霉菌自身代谢产生的挥发性有机化合物，导致储存花生环境体系中出现不同挥发性有机化合物的消长。

图1 花生样品和霉菌不同生长阶段的气相色谱-离子迁移谱图Fig.1 The GC-IMS topographic plots of peanuts samples and peanuts with different growth stages of mold

为进一步探究黄曲霉侵染不同生长阶段的花生样品中挥发性有机化合物消长规律，构建分析如图1B 气相色谱-离子迁移谱测定的黄曲霉侵染不同生长阶段的花生样品中芳香化合物的二维图谱。样品采样顶部空间中的总化合物和每个单独的挥发性化合物分别由整个光谱和离子反应峰右侧的点显示。物质信号强度用颜色显示，白色和红色分别表示低强度和高强度。图1B 结果表明侵染过程中大多数挥发性化合物信号的漂移时间在1.0～1.8 s 的范围内，保留时间在100～450 s 的范围内。

随后以P0 对照组谱图作为参考谱图，同时计算P0 参照谱图和其他各组谱图之间的差异构建如图1C所示。结果表明侵染实验组P1～P5 样品中的大多数挥发性有机化合物浓度信号远高于P0 对照组参考谱图，说明受侵染花生样品中黄曲霉不同生长阶段产生的挥发性有机化合物具有较大差异。对不同侵染阶段差异挥发性有机化合物进行有效区分是作为后期判断黄曲霉污染花生和污染程度的重要指标。

2.2 挥发性有机化合物物质鉴定

前期实验发现不同侵染阶段挥发性有机化合物种类和浓度具有明显差异，其中某种化合物也可能会以单体形式、二聚体形式或多聚体形式存在产生斑点或多种信号，造成谱图差异，具体取决于实际浓度和化合物性质。可通过鉴定不同侵染阶段挥发性有机化合物种类确定其成分来加以区分和判断，使用GC-IMS 自带的Library Search 软件将挥发性有机化合物的离子迁移谱漂移时间和保留指数与数据库中参考有机化合物数据比对进行组分分析[25−26]。最终从样品53 个峰中鉴定出34 种化合物单体及部分物质的二聚体，同时检测到有19 种目前尚无法确定具体物质的信号。各组样品中化合物种类相似度较高，图2 以样品P1 为例对其中的化合物进行定性分析。图2 化合物编号与表1 化合物编号一一对应。表1 展示了全部53 种化合物名称、CAS 编号、分子式、分子量、保留指数、保留时间和漂移时间及暂时无法定性分析确定的C1～C19 物质。

图2 霉变花生样品的离子迁移谱Fig.2 Ion mobility spectra of moldy peanut

表1 霉变花生样品中鉴定化合物的信息Table 1 Information on the identified compounds in moldy peanuts

续表1

2.3 挥发性有机化合物指纹图谱与热图聚类分析

为了更加直观地观察样品侵染过程中挥发性物质的变化规律和相对含量变化，借助 Gallery Plot 插件绘制挥发性物质的指纹谱图，直观比较了不同样品之间的挥发性有机化合物差异。如图3 所示为绘制黄曲霉菌侵染花生（从第0～5 d）样品中挥发性有机化合物种类和浓度的差异指纹图谱。每种芳香化合物的信号强度表示其浓度水平[27]。由结果可知，a 区域P0 样品中糠醛、异戊酸、二氢-2-呋喃酮、C3、C4 和C5 的信号强度很强；b 区域3-甲基丁醛、苯乙醛、戊-1-醇、壬醛、戊-2-壬醛、己醛、2，3-丁二酮和己酸等挥发性有机化合物主要存在于霉变早期阶段样品P1～P3 中；辛-1-烯-3-醇、2-庚酮、3-甲基磺酰基-丙醇、戊-2，4-庚二烯醛、戊-2-辛烯醛、2-辛酮、C1、C2 和C14～C18 等c 区域中的挥发性有机化合物在侵染后期P4，P5 样品中的浓度高于在样品P0～P3 中的浓度。结果表明实验组所设置不同侵染阶段挥发性有机化合物差异明显，具有明显区分度，为后续进一步的产品监测提供可能。

图3 花生样品挥发性成分的指纹图谱Fig.3 Fingerprints of the volatile compounds of the peanut samples

通过挥发性有机化合物的聚类分析以直观地比较不同化合物之间的差异性和相似性[28]。聚类分析结果如图4 所示，将5 个花生样品组分为3 组：对照组（P0），霉变前期阶段（P1～P2）和霉变后期阶段（P3～P5）；将样品中的挥发性化合物分为四类：a 类、b 类、c 类和d 类。其中a 组挥发性有机化合物主要存在于对照组P0，b 组和d 组挥发性有机化合物主要产生于霉变后期组（P3～P5），c 组挥发性有机化合物主要产生于霉变前期组（P1～P2），所设置样品组和挥发性有机化合物组具有较好的代表性。

图4 花生样品中挥发性化合物的热图聚类分析Fig.4 Heat map and cluster analysis of volatile compounds from the peanut samples

图3 和图4 结果表明P0 对照样品组中异戊酸、二氢-2-呋喃酮、正己醇-D、C3、C4、C5、C7 和C13 的信号远高于被黄曲霉侵染的样品组。P0 对照样品组中几乎没有2-己烯-1-醇-M、戊-1-醇-M、己醛、己酸、2，3-丁二酮、C6 和C8 等挥发性有机化合物检出。但这些挥发性有机化合物的信号在P1～P2 霉变前期阶段最强，同时信号强度随着霉菌生长时间的延长而减弱。而P4～P5 霉变后期阶段样品中主要检出有戊-庚-2-烯醛-D、戊-2-辛烯醛-D、2-辛酮-D、2-庚酮-D、辛-1-烯-3-醇、2-辛酮-M、3-甲基丁-1-醇、庚醇、3-甲基磺酰基-丙醇和乙酸乙酯等挥发性有机化合物。结果表明在整个霉变过程中，样品中挥发性有机化合物的种类逐渐增加，不同霉变阶段有其独特的挥发性有机化合物。其中c 类化合物和d 类化合物是实现花生样品霉变早期监测和预警的重要分子标志物。

2.4 挥发性有机化合物主成分分析

进一步分析所得数据结果，通过分析数据变化并集中可视化数据进行主成分分析[29−30]。如图5 A 是根据整个数据分析所得的主成分分析数据，将主成分分为1 和2 两部分。其中主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的主成分分析双标图占数据集总方差的95%。PC1 在数据中占87.2%的方差，PC2 占7.8%的方差。将主成分分析结果划分为四个不同的区域，其中a 区包括P0 对照，b 区包括P1 和P2 霉变早期阶段，c 区包括P3 霉变中期阶段，d 区包括P4 和P5 霉变后期阶段。c 区域和d 区域样品之间的挥发性有机化合物浓度出现高度的相似性，但b 区域和其他区域具有显著差异。该主成分分析结果与前期聚类分析热图结果类似。

使用主成分载荷图筛选识别对不同主成分聚类贡献最大的挥发性有机化合物绘制图5 B。其中向量的方向和长度表示变量对两个主成分的贡献程度。发现C9 几乎平行于Y 轴，表明C9 是导致主成分1 差异的主要因素。对挥发性有机化合物之间的相似性进行分析绘制图5 C，结果表明花生样品中黄曲霉生长前期（P1～P2）与生长中后期（P3～P5）的差异较大，霉菌侵染早期阶段P1，P2 的花生样品可以与对照组P0 较好地区分开，此结果为花生中黄曲霉污染的早期监测与预警提供可能。

图5 花生样品挥发性成分的主成分分析及相似性分析Fig.5 PCA and similarity analysis of VOCs from the peanut samples

3 结论

所有真菌在其生理活动过程中都会产生并排放挥发性有机化合物，但每种真菌排放的挥发性有机化合物的数量和质量组成均不同[31]。本研究采用气相色谱-离子迁移谱技术，在不需样品前处理的情况下，从受黄曲霉污染的花生中鉴定出53 种挥发性化合物，其中包含有很多目前尚未见报道和未能确定的组分，这部分未知物质（C1～C19）需要后续进一步研究。实验结果表明在霉菌不同的生长阶段，花生样品中的风味物质丰度和组成差异很大，为后续利用不同侵染阶段风味物质丰度和组成差异判断及区分花生产品质量与安全问题提供了可行的方法。

本研究首次报道了利用气相色谱-离子迁移谱结合指纹图谱分析、主成分分析和谱图评价受黄曲霉污染的储存花生中挥发性有机化合物的成分、丰度和组成差异。通过聚类分析和主成分分析发现霉菌不同生长阶段出现不同的挥发性有机化合物成分。其中己酸、2，3-丁二酮、2-己烯-1-醇、戊-1-醇、己醛、C6 和C8 化合物在霉菌感染早期丰度最强，并且其浓度信号随着生长时间的增加而减弱。KARLSHØJ等[32]曾研究发现某些真菌毒素合成过程中会释放挥发性化合物乙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇丙酮、2-丁酮和2-戊酮等，可通过电子鼻监测来预测真菌污染。LI 等[33]使用气相色谱-离子迁移谱技术研究了玉米霉变过程中挥发化合物变化，发现乙酸乙酯和3-羟基丁烷-2-酮可以作为玉米被黄曲霉菌感染的早期预警分子。ZHANG 等[34]指出CO2 和过氧化氢酶可作为玉米储藏过程中受真菌毒素污染的预警指示分子。可见，黄曲霉侵染不同的粮食作物可能产生特异性的挥发化合物。本研究为仓储条件花生早期霉菌污染的气体监测传感器研制提供了有效监测靶点分子，可基于这些标识分子设计仓储条件下的花生霉变实时在线监测和预警系统[33]。同时本研究样品采样检测过程中不需外加处理过程，采集仓储环境挥发性有机化合物气体即可高效敏捷监测农产品，为花生早期霉变预警监测提供了新思路，具有极大的应用前景。