低氘水联合富血小板血浆对糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用及TGF-β1表达的影响

赵超然 王湘琦 熊爱兵

[摘要]目的：觀察低氘水（Deuterium-depleted water，DDW）联合富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）对糖尿病大鼠胰岛细胞保护作用及TGF-β1表达的影响，初步探讨其对保护糖尿病大鼠胰岛细胞、促进糖尿病溃疡愈合的可能机制。方法：通过高糖高脂饲料喂养配合腹腔注射链脲菌素（STZ）+背部皮肤全层切除建立糖尿病大鼠溃疡模型。成模后按随机数字法分为糖尿病模型组、低氘水组（DDW）、富血小板血浆组（PRP）和低氘水联合富血小板血浆组（DDW+PRP）。空白对照组采用腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液+背部皮肤全层切除建模。各组大鼠分别于治疗后3d、7d、14d检测随机血糖，创面愈合率。胰腺组织HE染色后观察其病理学改变，酶联免疫吸附法检测创面组织TGF-β1表达情况。结果：DDW组、DDW+PRP组干预14d后随机血糖较干预前降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。DDW组、PRP组、DDW+PRP组在干预7d、14d后创面愈合率高于糖尿病模型组，差异具有统计学意义（P<0.05）;DDW+PRP组在干预14d时创面愈合率高于DDW组、PRP组，差异具有统计学意义（P<0.05）;且与空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。胰岛组织学观察随干预时间延长，DDW组、DDW+PRP组较前相比，胰岛细胞在形态、数量、排列方式、染色颗粒分布情况均有明显改观。DDW+PRP组干预后7d、14d后TGF-β1含量高于DDW组、PRP组，差异具有统计学意义（P<0.05）;而DDW组、PRP组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论：低氘水联合富血小板血浆对2型糖尿病大鼠溃疡创面的愈合有显著促进作用，且低氘水对2型糖尿病大鼠胰岛细胞具有一定保护和修复作用。促进创面愈合机制可能与降低糖尿病大鼠随机血糖，改善胰岛细胞功能，提高创面组织中TGF-β1含量有关。

[关键词]低氘水;富血小板血浆;糖尿病;胰岛细胞;溃疡创面;转化生长因子β1

[中图分类号]R587.1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）06-0101-06

Effects of Deuterium-depleted Water Combined with Platelet-rich Plasma on Islet Cell Protection and TGF-β1 Expression in Diabetic Rats

ZHAO Chao-ran，WANG Xiang-qi，XIONG Ai-bing

（Department of Plastic and Burn Surgery，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，National Key Clinical Construction Specialty，Luzhou 646000，Sichuan，China）

Abstract： Objective  To observe the effect of deuterium-depleted water （DDW） combined with platelet-rich plasma （PRP） on the islet cell protection and TGF-β1 expression in diabetic rats， and explore its possible mechanism to protect islet cells of diabetic rats and promote the healing of diabetic ulcer. Methods  The ulcer model of diabetic rats were established by feeding high-sugar and high-fat feed combined with intraperitoneal injection of streptozotocin （STZ）+full-thickness resection of back skin. After modeling， they were divided into diabetes model group， deuterium-depleted water group （DDW）， platelet-rich plasma group （PRP） and deuterium-depleted water combined with platelet-rich plasma group （DDW+PRP） according to random numbers. The blank control group was modeled by intraperitoneal injection of citric acid-sodium citrate buffer+full-thickness resection of the back skin.Rats in each group were tested for random blood glucose and wound healing rate 3d， 7d， 14d after treatment. The pathological changes were observed after HE staining of pancreatic tissue.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the expression of TGF-β1 in wound tissue. The pathological changes were observed. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the expression of TGF-β1 in wound tissue. Results  The random blood glucose in the DDW group and DDW+PRP group after 14 days of intervention was lower than before， the difference was statistically significant （P<0.05）. The wound healing rate of the DDW group， PRP group， and DDW+PRP group was higher than the diabetes model group after 7d and 14d intervention （P<0.05）. The wound healing rate of the DDW+PRP group was higher than DDW group and PRP group （P<0.05）， and compared with the blank control group， the difference was not statistically significant （P>0.05）. With the extension of the intervention time， compared with the previous groups， the islet cells in the DDW group and DDW+PRP group were significantly improved in their morphology， number， arrangement， and distribution of stained particles. The content of TGF-β1 in the DDW+PRP group was higher than the DDW group and PRP groups at 7d and 14d after intervention （P<0.05）， but there were no significant difference between the DDW and PRP groups （P>0.05）. Conclusion  Deuterium-depleted water combined with PRP can significantly promote the healing of ulcer wounds in type 2 diabetic rats， and deuterium-depleted water can protect and repair the islet cells of type 2 diabetic rats. The mechanism of promoting wound healing may be related to reducing the random blood glucose of diabetic rats， improving the function of islet cells， and increasing the content of TGF-β1 in the wound tissue.

Key words： deuterium-depleted water; platelet-rich plasma（PRP）; diabetes; islet cells; ulcer wounds;  transforming growth factor-β1

据世界卫生组织报道，目前全球约4.22亿糖尿病患者，预计到2045年将达到6.93亿[1]。糖尿病患者在病程中可能会发展成糖尿病足溃疡，较小的皮肤伤口可引起慢性难愈性溃疡，并最终导致感染、坏疽甚至截肢[2]，产生巨大的社会和经济负担[3]。糖尿病溃疡创面血管生成受损，生长因子水平下降，募集炎性细胞到创面的趋化能力降低，创面血管化不良和慢性炎症状态限制了糖尿病足溃疡的愈合能力[4]。目前治疗主要目标是闭合伤口。在大多数情况下，换药和清创术在内的常规疗法无法获得令人满意的结果，目前迫切需要促进糖尿病足溃疡愈合的新策略[5]。天然水中氘和氢的比例（D/H）约1：6 600，即氘的体积分数为0.015%，通常氘浓度低于0.015%的水称低氘水（Deuterium-depleted water，DDW）[6]，其抗氧化、抗抑郁、抗肿瘤、降低血糖等生物学效应可用于治疗相关疾病[7-8]。前期学者报道低氘水对糖尿病大鼠损伤的胰岛β细胞具有减轻和修复作用[9]。富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）是全血经离心提取出的富含高浓度血小板、白细胞、纤维蛋白等血小板浓缩物。相关学者研究发现PRP对糖尿病慢性溃疡创面的愈合有独特优势，能显著促进愈合[10]。所以本次实验拟观察低氘水联合富血小板血浆对2型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用及对溃疡组织愈合影响。

1  材料和方法

1.1 实验动物：健康清洁级雄性SD大鼠120只，体质量（180±10）g，由辽宁长生生物股份有限公司提供，许可编号SCXK（辽）2015-0001。动物饲养于室温20℃～25℃，相对湿度50%～70%条件下。本次研究经西南医科大学动物伦理委员会审核同意，伦理编号：2020376。

1.2 主要试剂和仪器：链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、水合氯醛、葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸三钠（北京索莱宝公司）;大鼠TGF-β1 Elisa试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）;大鼠普通饲料（成都达硕生物科技有限公司）;大鼠高糖高脂飼料（北京科奥协力有限公司）;罗试血糖仪+试纸（活力型）;高速冷冻离心机（eppendorf 德国）;移液器（Finnpipette，20～200μl 上海金瑞科学仪器有限公司）;电热恒温箱（武汉-恒苏净科学仪器有限公司，37℃）;酶标仪（Rayto，RT-6100，450nm）;ZMX-998B型酶标洗板机;低氘水由泸州哈罗德健康科技有限公司提供;Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件（Media Cybernetics美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及模型制备：健康清洁级雄性SD大鼠120只适应性喂养1周后，随机数字法分为空白对照组20只，糖尿病组80只，取血组20只（不参与造模及分组）。分别称取各组大鼠体重，检测每组大鼠尾静脉血糖。空白对照组大鼠普通饲料喂养4周，糖尿病组大鼠高糖高脂饲料（67%维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+2.5%胆酸钠）喂养4周。造模前各组大鼠禁食12h，不禁饮。

空白对照组大鼠腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（与糖尿病组等体积），7d后采取断尾取血法测大鼠随机血糖。以7%水合氯醛腹腔注射（0.5ml/100g）麻醉，麻醉后大鼠固定于大鼠固定架，备皮、消毒，背部标记后制作面积大小为3cm×3cm创面，创面组织深达筋膜层，造模成功后随机选取18只空白对照组大鼠。数码相机拍照后无菌纱布覆盖创面，胶布固定。

糖尿病组大鼠予以单次腹腔注射30mg/kg的1%链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液（0.1mmol/L pH4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，低温、避光、临用前配制），注射后继续高糖高脂饲料喂养7d。7d后采取断尾取血法测大鼠随机血糖，随机血糖≥16.7mmol/L标志2型糖尿病大鼠模型建立成功。血糖不达标者3d后再次腹腔注射10mg/kg的1%链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）溶液，7d后再次检测血糖，随机血糖≥16.7mmol/L标志造模成功[11]。模型鼠予以7%水合氯醛腹腔注射（0.5ml/100g）麻醉，麻醉后大鼠固定于大鼠固定架，备皮、消毒，背部标记后制作面积大小为3cm×3cm创面，创面组织深达筋膜层。数码相机拍照后无菌纱布覆盖创面，胶布固定。将造模成功的72只大鼠按随机数字法分为糖尿病模型组、DDW组、PRP组及DDW+PRP组，每组各18只。

1.3.2 富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）的制备：每次从取血组取3～4只SD大鼠，称重后以7%水合氯醛腹腔注射（0.5ml/100g）麻醉，每只大鼠在直视下从腹主动脉取血约10ml，用预先装有ACD抗凝剂（1ml柠檬酸葡萄糖溶液）的真空离心管及一次性取血针提取全血，充分摇匀，取1ml全血做血小板计数为628×109。采用改良Landesberg法制作富血小板血浆，第1次离心在4℃和200g离心15min，离心后离心管血液分为3层，上层为上清液，中间层富含血小板，下层为红细胞层。在富含血小板层与红细胞层下方2mm处标记，用移液器提取标记线上全部液体，转移到另一空白离心管中后摇匀。第2次离心在4℃和500g离心10min，离心后液体分为两层，上层为贫血小板血浆（Platelet-poor plasma，PPP），下层为含有大量血小板、血浆和少量红细胞的混合物即PRP，用移液器移除贫血小板血浆层，剩余即为PRP。经全血细胞计数测得血小板计数4 163×109。

1.3.3 干预方法：空白对照组，0.9%氯化钠溶液灌胃，饮用普通水，溃疡局部消毒后0.9%氯化钠溶液纱布包扎;糖尿病模型组，0.9%氯化钠溶液灌胃，饮用普通水，溃疡局部消毒后0.9%氯化钠溶液纱布包扎;DDW组，低氘水灌胃，饮用低氘水，溃疡局部消毒后0.9%氯化鈉溶液纱布包扎;PRP组，0.9%氯化钠溶液灌胃，饮用普通水，溃疡局部消毒后涂抹PRP再用无菌纱布包扎;DDW+PRP组，低氘水灌胃，饮用低氘水，溃疡局部消毒后涂抹PRP再用无菌纱布包扎。大鼠灌胃剂量均为0.01ml/g/d。各组大鼠均单只单笼饲养，溃疡创面换药1次/天，PRP隔日涂抹于溃疡创面（剂量为100μl每个创面），更换清洁垫料1次/天。

1.4 观察指标

1.4.1 随机血糖：各组大鼠造模成功后，分别在未干预，干预后3d、7d、14d采用断尾取血法检测随机血糖水平。

1.4.2 创面愈合率：分别于造溃疡创面后（未干预），干预后3d、7d、14d对创面采取图像，使用Image Pro Plus6.0专业图像分析软件测量创面面积，计算创面愈合率。创面愈合率=（干预前创面面积-干预后创面面积）/干预前创面面积×100%。

1.4.3 胰腺组织观察：分别于造溃疡创面后3d、7d、14d，各组抽签法随机选取6只大鼠，麻醉后迅速摘取完整胰腺组织，4%甲醛固定、脱水、石蜡包埋切片、苏木精-伊红染色、封固，普通光学显微镜下观察胰岛组织病理学改变。

1.4.4 溃疡创面组织TGF-β1的检测：分别于造溃疡创面后3d、7d、14d，各组随机选取6只大鼠，测随机血糖后麻醉，取溃疡创面及创周5mm组织2～3块。立即置入液氮降温，放入-80℃冷冻保存。采用酶联免疫吸附法检测溃疡创面组织中TGF-β1表达量，过程严格按照试剂盒说明进行操作。

1.5 统计学分析：采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 大鼠一般情况及体质量变化：空白对照组大鼠反应灵敏，精神好，毛发光泽，皮脂厚，体重增长快。与空白对照组相比，糖尿病模型鼠毛发粗糙，光泽度下降，色黄，易脱落，出现多饮、多食、多尿症状，反应迟钝，活动度差，抓起时排便反射明显，体重增长慢。

2.2 各组大鼠血糖水平变化：空白对照组、糖尿病模型组、PRP组大鼠随机血糖在干预3d、7d、14d与干预前比较差异无统计学意义（P>0.05）;DDW组、DDW+PRP组大鼠在低氘水干预后随机血糖开始缓慢下降，干预14d时与干预前相比随机血糖降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 各组创面大体情况及创面愈合率比较：干预3d，各组大鼠大体观察创面无明显缩小，部分大鼠创面可见散在皮岛，创缘见不同程度渗出、水肿及少量出血，糖尿病模型组大鼠部分创缘间隙下可见少许脓性分泌物;干预7d，各组大鼠创面缩小肉眼可见，部分创面覆盖薄层痂壳，创面可见少许肉芽组织，渗出、水肿较前相比均有不同程度改观，皮岛数量较前增多，空白对照组程度最高，糖尿病模型组最低，随着时间推移各组大鼠创面均在逐步愈合;干预14d，空白对照组、DDW组、PRP组、DDW+PRP各组创面显著缩小，创面渗出、水肿明显消退，部分创面干燥结痂，愈合良好。糖尿病模型组大鼠创面明显缩小，创面仍有少量渗出，创面水肿较前减轻，愈合程度低于其他各组。见图1。

干预3d时，糖尿病模型组、DDW组、PRP组、DDW+PRP各组创面愈合率均明显低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;DDW+PRP组创面愈合率高于糖尿病模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;糖尿病模型组、DDW组、PRP组两两比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。各组愈合顺序为空白对照组>DDW+PRP组>PRP组>DDW组>糖尿病模型组。

干预7d时空白对照组创面愈合率高于糖尿病模型组、DDW组、PRP组、DDW+PRP组，差异有统计学意义（P<0.05）;糖尿病模型组创面愈合率低于DDW组、PRP组、DDW+PRP组，差异有统计学意义（P<0.05）;DDW组、PRP组、DDW+PRP组两两比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。各组愈合顺序为空白对照组>DDW+PRP组>PRP组>DDW组>糖尿病模型组。

干预14d时空白对照组创面愈合率高于糖尿病模型组、DDW组、PRP组，差异有统计学意义（P<0.05）;糖尿病模型组创面愈合率低于DDW组、PRP组、DDW+PRP组，差异有统计学意义（P<0.05）;DDW+PRP组创面愈合率高于DDW组、PRP组，差异有统计学意义（P<0.05）;DDW+PRP组创面愈合率虽低于空白对照组，但两者比较差异无统计学意义（P>0.05），此时创面愈合率达到高峰。各组愈合顺序为空白对照组>DDW+PRP组>PRP组>DDW组>糖尿病模型组。见表2、图2。

2.4 各组大鼠胰岛组织学改变：大鼠胰腺组织HE染色光学显微镜下观察，空白对照组大鼠胰岛数量多，未见胰岛破坏，胰岛细胞数量多，且排列均匀紧密，细胞之间界限清楚，细胞质均匀淡染，胞核清晰呈椭圆形，核仁可见。干预后3d，糖尿病模型组、DDW组、PRP组、DDW+PRP组与空白对照组相比，胰岛数量减少，体积变小，边界不清，部分可见毛细血管基膜下玻璃样变物质沉着，岛内细胞排列稀疏，胞浆空泡样变增多，细胞质着色浅，胞核固缩，部分细胞核脱失，染色质分布不均、边集。

干预后7d，DDW组、DDW+PRP组较前干预前相比，胰岛细胞数量稍增加，体积缩小，细胞排列结构较干预前有所改观，细胞间边界较前清晰，胞浆空泡样变减少，染色颗粒分布稍有改观，胰岛周围淋巴细胞浸润减少。

干预后14d，DDW组、DDW+PRP组较前干预前相比，胰岛细胞数量增加，细胞排列均匀，边界清晰可见，胞浆空泡样变明显减少，胞质均匀淡染，胞核清晰，染色质分布均匀，胰岛周围淋巴细胞浸润减少。随干预时间延长，胰岛细胞在形态、数量、排列方式、染色颗粒分布情况均有明顯改观。

干预后3d、7d、14d，糖尿病模型组、PRP组大鼠胰岛组织受损较重、胰岛细胞体积增大，细胞间排列明显紊乱、边界不清，多数胞浆呈空泡样变或疏松网状，染色颗粒分布不均，部分细胞核固缩、脱失，胰岛周围淋巴细胞浸润较多，较前相比均无明显改观。见图3～4。

2.5 对各组大鼠创面组织TGF-β1的影响：糖尿病模型组、DDW组、PRP组、DDW+PRP组大鼠创面组织中TGF-β1含量在3d、7d、14d均低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;而DDW组、PRP组及DDW+PRP组大鼠在干预后3d、7d、14d含量较糖尿病模型组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。PRP组在干预后3d与DDW组相比含量升高，差异有统计学意义（P<0.05），在干预后7d、14d两者差异无统计学意义（P>0.05）。DDW+PRP组在干预后3d与PRP组比较差异无统计学意义（P>0.05）;DDW+PRP组在干预后7d、14d创面组织中TGF-β1含量较DDW组、PRP组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3，图5。

3  讨论

创面愈合是一个复杂而有序的生物学过程，包括初期损伤及快速止血期、炎症期、增殖期、成熟期等阶段，在正常机体协调下愈合过程呈高度有序性及完整性[12]。糖尿病创面延迟愈合与神经血管病变及多种生长因子低表达相关，胰岛素抵抗及高血糖状态进一步延迟愈合。PRP是全血经离心提取出的富含高浓度血小板、白细胞、纤维蛋白等血小板浓缩物。活化后的血小板活化脱颗粒释放TGF-β、PDGF、IGF、EGF、VEGF等多种生长因子，其相互协同作用促进细胞增殖与分化，加速血管生成及组织修复[13]。近期研究证实在创面愈合受损的组织中TGF-β1表达下降[1]，与这些观察结果一致，本次观察到糖尿病模型组大鼠创面组织TGF-β1的低表达，PRP组、DDW组糖尿病大鼠TGF-β1蛋白表达水平升高，与同期糖尿病模型组相比，创面肉芽组织生成增多，渗出、水肿消退较快，创面愈合率显著提升。且DDW+PRP联合干预组大鼠与单一干预组相比，TGF-β1表达量、创面愈合率属同期最高。目前已发现TGF-β1参与了创伤愈合的各个过程，如细胞外基质（ECM）的合成、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达和成纤维细胞的分化。在皮肤损伤后活性TGF-β1能刺激成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，其特点是与受损前相比α-SMA的高表达[14]。此外，TGF-β1协同促进成纤维细胞对胶原的收缩，从而加速伤口愈合[15]。Tsai等[16]报道激活后的PRP内含大量纤维蛋白，相互交织形成网状结构形成生物支架，牵拉创缘向创面中心移动，使修复过程快速而有效。实验中发现经低氘水干预后的大鼠，TGF-β1蛋白水平、创面愈合率均升高，与富血小板血浆干预组相比两者差异不具有统计学意义。

低氘水具有抗氧化，抗抑郁，抗肿瘤，降低血糖等一系列生物学效应，可用于治疗相关疾病[7-8]。Zlatska等[17]发现DDW对离体人真皮成纤维细胞的增殖能力具有刺激作用，具有更高的增殖潜能。研究表明[7]DDW能提高12周龄Wistar-Kyoto大鼠胰岛素水平并降低血液中甘油三酯、胆固醇水平。在另一项研究中发现饮用DDW的大鼠血浆中糖蛋白总量及其糖基化程度均显着降低[18]。周振宇等[9]发现低氘白酒能降低糖尿病大鼠空腹血糖水平，提高空腹血清胰岛素水平;组织学观察显示低氘白酒具有减轻及修复损伤的胰岛β细胞。本实验研究发现经低氘水干预的糖尿病大鼠TGF-β1蛋白水平上升，创面愈合率与糖尿病模型组相比升高，愈合速度加快，在14d时随机血糖下降明显。推测可能与减轻胰岛素抵抗、增加胰岛素分泌有关。胰腺组织HE染色显示，随干预时间的推进，胰岛细胞在形态、数量、排列方式、染色颗粒分布情况均有不同程度改观。说明低氘水具有保护及修复受损胰岛细胞，降低糖尿病大鼠随机血糖水平，加速糖尿病大鼠溃疡创面愈合。本次实验DDW组、PRP组在TGF-β1蛋白水平、创面愈合率，两者差异均不具有统计学意义。而DDW+PRP组在TGF-β1蛋白表达上提升最明显，在干预14d时与DDW组、PRP组相比创面愈合程度最高，差异具有统计学意义。

综上，低氘水联合富血小板血浆能降低2型糖尿病大鼠随机血糖水平，对胰岛细胞具有一定保护和修复作用，能显著促进溃疡创面的愈合，可能与提高创面组织中TGF-β1蛋白含量有关，具体机制有待进一步研究探讨。

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[收稿日期]2020-11-05

本文引用格式：赵超然，王湘琦，熊爱兵.低氘水联合富血小板血浆对糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用及TGF-β1表达的影响[J].中国美容医学，2021，30（6）：101-106.