薏米醪糟发酵过程中代谢产物的分析

肖 琳，付月，王美婷，宝宇翔，王缤晨，董 亮*

（1 大连工业大学食品学院 辽宁大连 116034 2 国家海洋食品工程技术研究中心 辽宁大连 116034 3 沈阳市化工学校 辽宁沈阳 110122）

薏米（Coix chinensisTod.）又名薏苡仁、六谷子，有健脾、补肺、清热、降血糖、利湿、轻身益气等功效，《本草纲目》称其为上品“养心药”[1]。除此以外，薏米还有消炎、抗敏、降血压、降血脂、瘦身、美白等功效[2-5]。醪糟又名米酒，是江南地区传统特色小吃，而薏米醪糟是以薏米为原料，通过发酵酿制的具有保健功能的米酒，它区别于市面上常见的糯米醪糟，更加有利于女性健康[6]。目前薏米醪糟研究有较大的空白。之前，有姜丽等[7]采用气相-飞行时间质谱联用仪测定黑糯米酒后发酵过程中代谢产物的差异及其变化；邓开野等[8]和李小丽等[9]测量了发酵药用米酒和甜米酒中的氨基酸；Kim等[10]和Rahayu 等[11]研究发酵酒的代谢物变化。为弄清薏米醪糟发酵过程中代谢物形成机制及各环节的影响因素，研究薏米醪糟发酵过程中代谢产物的变化。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与设备

薏米，河北小黑壳薏米；安琪甜酒曲，安琪酵母股份有限公司；甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷、甲基叔丁基醚（MTBE）均为色谱级，美国 Spectrum 化学试剂公司；核糖醇、二十四烷、5α-胆甾烷-3β-醇均为标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MSTFA）、N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺＞97%（MTBSTFA），Sigma-Aldrich 公司；三甲基硅咪唑（TSIM），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

高速离心机（CR22N 型）、全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；冷冻干燥机（Scientz-10ND型），宁波新芝生物科技有限公司；气相色谱质谱联用仪（Agilent 7890A/5975C）、高效液相色谱（Agilent+1260+），安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 薏米醪糟的制作：挑选颗粒饱满、无杂质的薏米，清洗，用凉水浸泡25 h 后置100 ℃蒸50 min 得薏米A。用水冲淋或自然晾干，降温至30 ℃，沥去水分，加入酒曲和纯净水，拌匀，33 ℃发酵72 h，得薏米醪糟。其中，酒曲的添加量为薏米质量的1%，水的添加量为薏米质量的100%。分别在发酵0，12，24，36，48，60，72 h 取出，醪糟样品于-80 ℃迅速降温，并立即冻干，得到的冻干薏米醪糟粉置于-30 ℃保藏，备用。

1.2.2 游离氨基酸的测定 分别在发酵0，12，24，36，48，60，72 h 取出薏米醪糟冻干粉100 mg，加入1 mL 水，10 000 r/min 离心10 min，得上清液。上清液中加入1 mL 丙酮离心，取上清液，吹干后加入1 mL 0.02 mol/L 盐酸定容，过0.2 μm 水系滤膜，用氨基酸分析仪测定游离氨基酸。

1.2.3 游离糖的测定 分别在发酵0，12，24，36，48，60，72 h 取出薏米醪糟冻干粉100 mg，各加入4∶1 的甲醇水溶液5 mL，振荡后超声萃取20 min。随后4 000 r/min 离心15 min 得上清液。取50 μL上清液，加入30 μL 作为内标的核糖醇（10 μg/mL），用氮吹仪吹干后用250 μL 乙腈复溶，加入50 μL 三甲基硅咪唑进行硅烷化衍生，取1 μL 做GC-MS 分析。色谱条件：色谱柱为Agilent HP-5MS（30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm）；柱温：初始温度60 ℃，以5 ℃/min 速率程序升温至300 ℃，保持5 min；载气为氦气，载气流速1 mL/min，进样口温度260 ℃。质谱条件：EI 电离源，电离能量70 eV；离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，采集方式为scan 模式。

1.2.4 脂类测定 脂质物质的萃取：取100 mg 薏米醪糟冻干粉，参考陈炎[12]的方法，取1 μL 溶液做GC-MS 分析。

2 结果与分析

2.1 薏米醪糟发酵过程代谢轮廓分析

在薏米醪糟发酵过程中，共检测到49 种小分子代谢物（见表1至表4）。与焙烤过程中这些代谢物含量存在显著差异（P<0.05），其中氨基酸与糖类为极性代谢物组分，剩余的为非极性组分。

72 h 60 h ab 19.55±0.96 a 23.65±4.42 a 95.86±11.57 b 63.54±8.7 a 16.7±1.08 b 10.73±1.54 bc 48.03±5.39 a 79.54±17.63 a 32.39±4.96 b 19.49±3.01 bc 5.01±0.45 ab 7.2±2.93 a 120.98±1.92 b 109.73±2.43 b 2.44±0.23 b 2.68±0.43 a 34.57±3.7 b 19.96±2.28 a 6.84±0.8 b 2.49±0.15 a 18.74±1.76 b 7.1±1.19 a 64.72±7.38 b 35.85±5.96 a 180.04±19.5 b 105.32±19.17 a 141.91±36.27 b 105.91±11.04 a 23.06±2.52 b 13.79±2.11 a 29.61±3.14 b 17.52±3.16 a 74.31±9.10 b 43.62±7）2 μg/g（10化变的酸基氨离游中程过酵发1表）2 μg/g（10 The changes of free amino acids during fermentation Table 1 48 h 36 h 24 h 12 h 0 h b 16.5±3.46 b 17.08±0.23 c 8.18±1.47 d 2.81±0.20 d 1.55±0.04 c 45.77±2.02 c 48.29±1.75 c 40.35±3 d 3.44±0.21 d 4.99±0.02 c 6.24±1.55 c 6.79±0.47 c 4.78±0.49 d 1.43±0.17 d 1.51±0.01 b 58.87±5.48 b 56.19±2.09 c 38.93±0.4 d 6.01±0.32 d 4.36±0.00 c 17.48±0.2 bc 16.69±0.13 c 15.51±1.3 d 1.19±0.09 d 1.13±0.01 a 8.45±0.48 ab 7.13±0.44 cd 3.34±0.06 d 1.02±0.08 d 0.96±0.26 b 113.39±5.88 c 100.99±2.01 d 68.65±2.92 e 5.68±0.30 e 4.04±0.44 a 3.23±0.13 b 2.51±0.15 c 1.10±0.02 d 0.13±0.02 d 0.10±0.04 b 19.46±1.06 c 15.96±0.74 d 10.9±0.71 e 1.7±0.06 e 1.06±0.07 b 2.52±0.18 b 2.40±0.17 c 0.97±0.05 d 0.18±0.00 d 0.19±0.00 bc 5.77±0.43 c 4.07±0.04 d 1.86±0.03 d 0.28±0.02 d 0.28±0.01 bc 31.95±1.63 c 25.12±2.28 d 14.54±0.4 e 2.02±0.04 e 1.17±0.02 b 82.82±3.12 c 55.43±5.94 d 31.54±0.49 e 5.78±0.24 e 3.23±0.06 b 95.18±6.74 b 75.25±1.57 c 35.18±4.56 c 3.5±0.73 c 3.46±0.42 bc 12.13±0.28 c 10.39±0.23 d 5.42±0.04 e 2.47±0.15 e 1.26±0.39 c 13.38±0.68 c 12.31±0.53 d 6.90±0.18 e 2.4±0.18 e 1.46±0.09 bc 36.92±0.98 c 30.82±1.27 d 17.49±1.43 e 3.17±0.28 e 1.57±0.06）。（P<0.05异差性著显示”表，e，d，c，b”；“a差偏物合化号序酸氨冬天1酸氨苏2酸氨丝3酸氨谷4酸氨脯5酸氨甘6酸氨丙7酸氨胱半8酸氨缬9酸氨蛋10酸氨亮异11酸氨亮12酸氨酪13酸氨丙苯14酸氨赖15酸氨组16酸氨精17准标±值均“平的复重次3为据：数注

72 h 60 h ab 19.55±0.96 a 23.65±4.42 a 95.86±11.57 b 63.54±8.7 a 16.7±1.08 b 10.73±1.54 bc 48.03±5.39 a 79.54±17.63 a 32.39±4.96 b 19.49±3.01 bc 5.01±0.45 ab 7.2±2.93 a 120.98±1.92 b 109.73±2.43 2 μg/g）（10化变的糖离游中程过酵发2表2μg/g）The changes of free sugar during fermentation（10 Table 2 48 h 36 h 24 h 12 h 0 h b 16.5±3.46 b 17.08±0.23 c 8.18±1.47 d 2.81±0.20 d 1.55±0.04 c 45.77±2.02 c 48.29±1.75 c 40.35±3 d 3.44±0.21 d 4.99±0.02 c 6.24±1.55 c 6.79±0.47 c 4.78±0.49 d 1.43±0.17 d 1.51±0.01 b 58.87±5.48 b 56.19±2.09 c 38.93±0.4 d 6.01±0.32 d 4.36±0.00 c 17.48±0.2 bc 16.69±0.13 c 15.51±1.3 d 1.19±0.09 d 1.13±0.01 a 8.45±0.48 ab 7.13±0.44 cd 3.34±0.06 d 1.02±0.08 d 0.96±0.26 b 113.39±5.88 c 100.99±2.01 d 68.65±2.92 e 5.68±0.30 e 4.04±0.44）。（P<0.05异差性著显示”表，e，d，c，b”；“a差偏物合化号序糖果）-（-D-1糖乳半2醇糖梨山D-3糖萄D-葡4糖蔗5糖二松）-（+D-6苷糖乳半喃吡α-D-7准标±值均“平的复重次3为据：数注

72 h 60 h c 7.09±0.21 b 9.47±0.82 bc 0.29±0.02 bc 0.31±0.02 b 24.9±1.70 c 18.23±0.55 c 23.91±1.71 b 27.9±2.66 d 2.09±0.06 c 2.48±0.15 c 0.27±0.00 c 0.37±0.01 d 0.33±0.01 bc 0.44±0.01 d 0.06±0.01 ab 0.14±0.02（mg/g）化变的酯甲酸肪脂中程过酵发3表The changes of fatty acid methyl esters during fermentation（mg/g）Table 3 48 h 36 h 24 h 12 h 0 h c 8.29±1.06 c 7.67±0.22 c 7.71±0.02 c 7.6±0.02 a 15.02±0.44 c 0.29±0.03 d 0.25±0.03 ab 0.34±0.01 d 0.22±0.00 a 0.37±0.00 d 9.25±1.69 d 8.61±0.30 d 9.22±0.60 d 8.25±0.15 a 38.90±0.82 d 17.58±0.39 d 18.86±0.30 d 19.00±0.51 d 19.88±0.38 a 33.75±1.87 cd 2.25±0.12 e 1.78±0.01 b 2.83±0.20 f 1.46±0.02 a 3.66±0.05 bc 0.38±0.04 c 0.3±0.06 a 0.55±0.10 bc 0.36±0.02 ab 0.48±0.01 b 0.5±0.06 cd 0.39±0.06 b 0.48±0.04 bc 0.45±0.03 a 0.66±0.01 ab 0.16±0.01 bc 0.12±0.03 a 0.16±0.01 c 0.1±0.02 ab 0.13±0.01）。（P<0.05异差性著显示”表，e，d，c，b”；“a差偏准物合化号序酸烷六十1酸烯六十9-2酸油亚3酸油4酸烷八十5酸烯碳十二11-6酸烷十二7酸烷二十二8标±值均“平的复重次3为据：数注

72 h 60 h c 2.24±0.05 b 4.33±0.33 c 0.47±0.bc 0.65±0.06 c 1.92±0.03 b 3.32±0.26 b 4.1±0.02 a 9.52±1.05 d 2.03±0.04 cd 2.71±0.22 b 3.6±0.1 b 4.77±0.47 c 1.95±0.37 c 1.23±0.1 b 131.74±3.78 a 217.07±5.16 cd 3.88±0.01 b 5.65±0.78 b 42.45±3.1 c 27.25±3.99 b 159.78±3.76 b 145.47±20.73 b 13.47±0.33 b 21.65±3.39 bc 86.00±4.19 a 136.6±4.17 bc 1.77±0.04 a 3.74±0.67 c 0.92±0.06 b 4.4±0.53 b 30.59±0.04 a 36.43±0.72 b 134.89±0.76 a 165.37±4.24）（10 μg/g化变的醇、甾酸机有和肪脂离游中程过酵发4表）（10 μg/g，organic acids and sterols during fermentation The changes of free fat Table 4 48 h 36 h 24 h 12 h 0 h b 3.26±0.44 b 4.28±0.11 bc 3.77±0.9 c 2.3±0.03 a 8.81±0.71 bc 0.66±0.11 bc 0.81±0.04 b 1.05±0.11 c 0.42±0.04 a 2.75±0.56 d 0.67±0.08 c 2.29±0.01 b 3.57±0.11 c 1.64±0.06 a 4.71±0.41 d 0.79±0.04 c 2.24±0.19 c 2.79±0.39 d 0.93±0.24 b 4.42±0.28 cd 2.39±0.58 b 4.51±0.08 c 3.07±0.37 c 3.34±0.84 a 8.45±0.21 b 3.53±0.63 b 4.22±0.16 b 4.71±0.62 b 4.37±0.67 a 13.16±2.95 c 2.12±0.37 c 2.31±0.29 c 1.98±0.43 b 8.73±0.56 a 17.89±0.99 d 85.17±4.92 e 43.32±1.43 b 144.05±4.18 c 114.37±6.61 d 95.25±10.22 d 2.96±0.36 d 2.62±0.11 cd 3.71±0.15 bc 4.8±0.55 a 13.47±1.11 e 12.00±1.46 cd 23.7±1.11 de 14.58±3.64 e 7.15±1.01 a 54.52±11.31 e 27.11±2.52 c 88.84±4.71 d 32.89±10.01 d 29.1±4.15 a 339.38±23.79 b 20.8±3.06 b 21.35±2.81 b 15.68±0.36 b 13.43±0.55 a 66.24±11.68 d 56.85±6.11 e 10.35±6.17 b 101.79±5.96 c 75.66±4.56 d 47.38±15.79 d 0.61±0.1 d 0.99±0.21 cd 1.21±0.14 d 0.82±0.05 b 2.35±0.32 c 1.66±0.08 c 0.52±0.10 c 0.75±0.15 a 12.81±2.86 bc 2.11±0.15 b 28.68±1.19 c 21.52±0.84 b 28.43±0.7 b 29.21±0.72 b 29.71±2.63 e 13.18±1.04 d 54.63±5.6 b 131.98±3.2 c 127.68±1.55 b 114.94±6.98）。（P<0.05异差性著显示”表，e，d，c，b”；“a差偏准物合化号序酸二丁1酸壬2酸奎3酸果苹4酸蔻豆肉5酸烷五十6酸烯六十9-7酸烷六十8酸烷七十9酸油亚10酸油11酸烯碳八十11-12酸烷八十13酸烯碳十11-二14酸烷十二15醇甾油菜16甾豆17标值±均“平的复重次3为据：数注

极性组分中，未发酵时氨基酸中苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量较高，而以苏氨酸含量最高，为4.99×102μg/g。发酵后期，丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量较高，发酵72 h 时酪氨酸含量高达180.04×102μg/g。与未经处理的薏米相比，发酵前蒸制薏米中葡萄糖含量最高达4.36×102μg/g，并在发酵过程中持续升高，这是发酵过程中淀粉水解的缘故。非极性组分中，发酵0 h 的油酸甲酯和亚油酸甲酯含量较高，分别为38.90 mg/g 和33.75 mg/g，油酸甲酯和亚油酸甲酯含量在发酵开始时就下降且有显著性差异（P<0.05）。小分子有机酸如丁二酸、壬酸、奎酸等，它们的含量均减少且变化不明显。游离脂肪酸中较高含量的油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸下降明显，油酸氧化生成的饱和脂肪酸中含量较多为十六烷酸和十八烷酸，呈上升趋势。游离脂肪酸含量降低是因为发酵时微生物不适应新的环境或完成代谢而消失。

2.2 薏米醪糟发酵过程基础营养物质的变化

为探究基础营养物质的变化，对这些物质进行主成分分析。图1为代谢物质随发酵时间变化的得分图和载荷图，它反映不同发酵时间代谢组成的特点。

由图1a 可知，发酵0 h 和发酵12 h 可明显区分，而发酵24，36，48，60，72 h 区分不明显，其中24，36，48 h 比较靠近，60 h 和72 h 区分不明显。从图1b 和图1c 的载荷图可看出，发酵前12 h，极性和非极性代谢物虽有较明显的增加，但趋势不尽相同。对应于图1a 载荷图相应区域的壬酸、奎酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、甘氨酸、苏氨酸、二十烷酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸在发酵前期聚集，表明这些化合物对醪糟的代谢物组成有很大贡献。

图1 发酵过程中整体代谢物（a）和极性（b）、非极性（c）代谢物主成分分析Fig.1 Analysis of principal components of overall metabolites（a），polar（b）and non-polar（c）metabolites during fermentation

为了进一步反映发酵过程中不同代谢物的变化趋势，对不同代谢物进行热度图分析，如图2所示。鲜、甜、酸等多味氨基酸使醪糟有丰富的味觉层次，鲜美、柔和[13]。在发酵0 h 时检测到17 种游离氨基酸，它们含量差别不大，仅苏氨酸含量稍高。发酵12 h 后色块颜色逐渐由冷色调向暖色调变化，所有氨基酸含量都小幅的增加，其中，苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸变化较为明显，而蛋氨酸没有显著的变化。苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸为甜味氨基酸，酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸为苦味氨基酸，随着发酵时间的延长醪糟苦涩味儿越来越明显。发酵24 h 后，氨基酸色块颜色变化开始显著，发酵60～72 h 颜色变化不明显。氨基酸的增长主要是因氨基酸从微生物细胞中溶出，它具有的呈味会促进薏米醪糟感官品质的形成[14]。从整体发酵过程也可看出发酵时间对氨基酸含量有较大影响。

图2 发酵过程中代谢物组分变化Fig.2 The changes of metabolite components during fermentation

糖类为主要的碳源被消耗，通过碳水化合物代谢途径为微生物的生长提供能量[15]。酒曲中的根霉菌和酵母分泌淀粉酶，将淀粉分解为葡萄糖，葡萄糖进行糖酵解，这是糖在发酵过程中的变化途径。从图3可以看出，发酵0 h 时共检出7 种游离糖，在发酵过程中变化最明显的是葡萄糖和半乳糖，这两种糖含量从发酵24 h 开始显著增加，而其它二糖，如蔗糖和松二糖则变化不明显。淀粉水解为葡萄糖后，醪糟糖度增加，发酵36 h 时达到最高，随后下降。发酵时间过短，醪糟风味不佳，入口不够甘甜、醇厚，而发酵时间过长，淀粉酶被抑制，出酒率低，醪糟出现刺激性馊味儿。

脂肪酸对米酒风味的形成有很大的作用[16]，它们主要来源于原料。由脂类物质的热度图可看出，发酵过程中非游离脂肪酸除油酸和亚油酸的变化不明显外，其大部分由含量较低且变化不大的脂肪酸组成。油酸和亚油酸的变化是因发酵时微生物的改变导致代谢平衡被打破，且油酸亚油酸结构不稳定易于氧化。醪糟中有机酸兼具呈香和呈味两种作用，还可以抑制杂菌的生长[17]，醪糟中的小分子有机酸主要来源于微生物代谢，它们的比例大小对醪糟品质的影响较大。从图2可以看出，小分子有机酸热图上色块变化不明显，且实际含量变化均减少。对游离脂肪酸来说，油酸、亚油酸、11-十八碳烯酸等不饱和脂肪酸含量明显下降，而十六烷酸和十八烷酸等饱和脂肪酸呈先增加后减少再增加的趋势。这是由于随着发酵的进行，微生物不适应新的环境或完成代谢过程而消失[18]，导致脂肪酸含量下降。Manosroi 等[19]研究发现，当制作醪糟的原料为紫米时，发酵时油酸、亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸含量增加。本研究中亚油酸和油酸含量在发酵后较发酵前大幅下降，这与醪糟原料、酒曲差异和发酵时间相关。甾醇类物质在热图中的变化不明显，处于较低的含量水平。

3 结论

本研究结果表明：氨基酸含量从发酵12 h 开始增加，在发酵24 h 后，氨基酸色块颜色变化显著，这是由于氨基酸从微生物细胞中溶出。在发酵过程中变化明显的是葡萄糖和半乳糖，这两种糖含量从发酵24 h 开始显著增加，而其它二糖如蔗糖和松二糖变化不明显。脂类物质发酵过程中非游离脂肪酸大多变化不明显，它们的变化是因微生物的出现而打乱代谢平衡，结构不稳定易于氧化造成的。对游离脂肪酸来说，油酸等不饱和脂肪酸含量下降明显 ，而十六烷酸等饱和脂肪酸呈先增加后减少再增加的趋势。