抗坏血酸处理对鲜榨莲藕汁酶促褐变和品质特征的影响

李彩云，李 洁，2，3*，严守雷，2，3，王清章，2

（1 华中农业大学食品科学技术学院 武汉 430070 2 湖北省水生蔬菜保鲜加工工程技术研究中心 武汉 430070 3 教育部长江经济带常规水生生物产业绿色发展工程研究中心 武汉 430070）

果蔬汁在加工和储存过程中因褐变反应而导致营养质量下降，感官发生变化，使消费者对食品的接受度降低[1-2]。果汁的褐变分为酶促褐变和非酶褐变，酶促褐变主要发生在榨汁加工过程中，非酶褐变主要发生在贮藏期间[3-4]。酶促褐变在果汁加工中尤为严重，果蔬组织被彻底破坏后，加速了多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和酚类化合物的自由接触。在氧气充足的情况下，酚类化合物在PPO 的催化下氧化成醌，再进一步发生氧化聚合等非酶促反应，最终导致褐色色素的形成[5]。抗坏血酸（Ascorbic acid，AA）是一种很强的抗氧化剂和抗褐变剂，因具有良好的还原性，能够降低体系的pH 值，对金属无腐蚀作用，且具有营养价值等优点，而在果蔬加工中广泛应用[6-8]。抗坏血酸在酶促褐变中的作用是抑制PPO 的活性，降低氧气含量，褐变中间产物醌在进一步反应形成褐色色素前被还原为原始酚类化合物，对抑制果蔬酶促褐变有很好的效果[9]。

近年来，湖北省莲藕产量迅速增加，开发莲藕深加工产品，提升莲藕产品价值是科研工作者要面对的问题[10-11]。目前市场上有保鲜藕片、藕粉、藕汁等莲藕产品，其中莲藕汁饮料四季皆宜，有生津清热、养胃滋阴、健脾益气等功效，受到广大消费者喜爱[12]。然而，莲藕中含有丰富的酚类物质，在榨汁加工过程中极易发生酶促褐变，从而影响产品的感官和品质。本研究比较不同浓度的AA 对鲜榨莲藕汁的护色效果，探究AA 对莲藕汁酶促褐变的影响，同时考察添加AA 对莲藕汁品质特征的影响，分析莲藕汁酶促褐变与品质间的关系，为AA 对莲藕汁的护色和品质控制提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所用莲藕品种为鄂莲五号，购买于华中农业大学农贸市场。抗坏血酸、邻苯二酚、愈创木酚、没食子酸、考马斯亮蓝G-250、2，6-二氯酚靛酚等（分析纯级），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-754N 紫外-可见分光光度计，上海奥普勒仪器有限公司；UltraScan PRO 全自动色差仪，美国Hunter Lab 公司；PHS-3C 型pH 计，上海雷磁仪器厂；高速冷冻离心机，Thermo Fisher 公司；PAL-1 型手持式糖度计，ATAGO （爱拓）中国分公司。

1.3 方法

1.3.1 莲藕汁的制备 取冷藏于冰箱中的白色莲藕，无腐烂变质，洗去泥土，去节、削皮，消毒，切块。配制不同浓度（2，4，6，8 mmol/L）的AA，莲藕和AA 溶液按体积比1∶1 混合，在打浆机中打浆约5 min，得莲藕粗液，用800 目筛过滤，放入干净玻璃瓶中4 ℃储藏12 h，以蒸馏水代替AA 溶液为对照组。

1.3.2 酶促褐变指标的测定

1.3.2.1 莲藕汁褐变度的测定 取莲藕汁5 mL，按体积比1∶1 加入95%的乙醇溶液，混合振荡10 min 后在8 000 r/min 条件下离心10 min，去除样品中的粗纤维和颗粒。取10 mL 上层清液，用紫外-可见分光光度计测定其在波长420 nm 处的吸光度，以A420nm表示莲藕汁的褐变指数，以V蒸馏水∶V95%乙醇=1∶1 的混合液做空白对照[13]。

1.3.2.2 莲藕汁总酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu 法测定藕汁中总酚含量[14]。试验算得没食子酸标准曲线方程为y=0.0014x+0.0181，R2=0.9953。量取莲藕汁5 mL，加入10 mL 40%乙醇均质，用5 mL 40%乙醇转移到100 mL 三角瓶中，保鲜膜封口超声5 min，50 mL 离心管在5 000 r/min 条件下离心15 min，收集上清液，残渣用5 mL 40%乙醇转移，5 000 r/min 条件下离心15 min，合并上清液。取0.5 mL 上清液，加入福林酚试剂3 mL，再加10%Na2CO3，定容至10 mL，以蒸馏水作参比，在波长765 nm 下测吸光值，每组平行3 次。

1.3.2.3 可溶性醌含量的测定 取1.3.2.2 节离心后的上清液于波长437 nm 测其吸光度[15]。

1.3.2.4 莲藕汁多酚氧化酶活性的测定 取藕汁10 mL，加入0.1 mol/L pH 7.0 的磷酸盐缓冲液【内含3%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）】30 mL，用高速组织捣碎机匀浆12 s，然后10 000 r/min 离心10 min，取上清液作为莲藕汁PPO 粗酶液。上述操作在4 ℃下进行[16]。

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向0.1 mL 酶液中加入1.9 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.0），25 ℃保温5 min，加入1.0 mL 邻苯二酚（20 mmol/L PBS 配制）启动反应。在波长420 nm处测定吸光值，每10 s 记录1 次，共2 min。每毫升酶液每分钟引起吸光值变化0.001 为1 个酶活单位[17]。

1.3.2.5 过氧化物酶活性的测定 过氧化物酶（Peroxidase，POD） 活性测定采用愈创木酚法[18]。总反应体积为400 μL，反应体系为30 μL 粗酶液，290 μL 0.3%愈创木酚 （用50 mmol/L PBS 配制，pH 7.0）和80 μL 0.3% H2O2（用50 mmol/L PBS配制，pH.0），加入H2O2后开始准确记时，连续测定A470nm的变化值，每毫升酶液每分钟引起吸光值变化0.01 为1 个酶活单位。

1.3.3 莲藕汁品质特征的测定

1.3.3.1 白度、可溶性固形物、黏度和酸碱度的测定 利用色差仪反射原理，测定莲藕汁白度（L值）变化[19]。可溶性固形物、黏度和酸碱度分别采用数字阿贝折光仪、黏度计和pH 计测定[20]。

1.3.3.2 莲藕汁中总蛋白含量的测定 采用考马斯亮蓝G-250 法进行测定[21]。试验得到牛血清蛋白标准曲线方程为y=5.2629x+0.0699，R2=0.999。莲藕汁在6 000 r/min 条件下离心10 min，取离心后的莲藕汁0.5 mL，加入0.5 mL 蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝，充分混匀，在室温下反应10 min，以空白调零，在波长595 nm 处测吸光值，根据牛血清蛋白标准曲线来计算样品中总蛋白含量。

1.3.3.3 莲藕汁中VC 含量的测定 采用2，6-二氯靛酚滴定法进行测定[22]。取离心后的莲藕汁5 mL，置于锥形瓶中，加入1%草酸溶液10 mL，3%H2O2溶液2 滴，摇匀，立即用2，6-二氯靛酚溶液滴定至由溶液变为玫瑰红色，15 s 内不褪色即为终点。莲藕汁中VC 含量按下式计算：

式中，T——2，6-二氯靛酚溶液的滴定度，mg/mL；V——2，6-二氯靛酚用量，mL；W——莲藕汁样品用量，mL。

1.4 数据处理方法

数据处理采用SPSS 25 进行显著性分析，Origin 2018 和Excel 2010 等图表制作软件对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同浓度抗坏血酸处理对莲藕汁酶促褐变的影响

图1 不同浓度的抗坏血酸处理对莲藕汁褐变度、总酚及可溶性醌类含量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of AA treatment on the browning degree，total phenol and soluble quinone content of lotus rhizome juice

2.1.2 不同浓度抗坏血酸处理对莲藕汁PPO、POD 酶活性的影响 在果汁加工过程中，PPO 和POD 是褐变反应中的主要酶类[26]。AA 处理的莲藕汁中PPO 和POD 活性见图2a 和2b，随着AA 浓度的增加，两种酶的活性逐渐降低。在试验浓度范围内，随AA 浓度增大，PPO 酶活较匀速下降，而POD 酶活在AA 浓度低于2 mmol/L 时几乎无变化，在AA 浓度继续增大时降幅显著加快。当AA浓度达到8 mmol/L 时，对PPO 和POD 的抑制率分别为77.78%和88.24%。研究发现抗坏血酸对薄荷PPO[27]、洋蓟PPO[28]和莴苣PPO[29]也有明显的抑制作用。随后的研究证实了抗坏血酸对PPO 活性具有竞争性抑制作用[30-31]，这表明多酚的再生并不是抗坏血酸作为抗褐变剂的唯一机制。当然，pH值在酶促反应中起着关键作用。莲藕PPO 和POD酶活的最适pH 值都为6.0[32]，随着抗坏血酸添加量增加，体系pH 值不断降低，这对PPO 和POD活性也有一定影响。

图2 不同浓度的抗坏血酸处理对莲藕汁PPO 和POD 酶活性的影响Fig.2 Effects of different concentrations of ascorbic acid treatment on the activity of PPO and POD enzymes in lotus rhizome juice

如表1所示，AA 浓度与总酚含量呈显著正相关，与可溶性醌含量呈极显著负相关，与PPO 和POD 活性呈显著负相关，说明AA 的添加影响了酶促褐变的主要指标，AA 浓度增加与各褐变指标间存在良好的相关性。AA 处理后的莲藕汁总酚含量与可溶性醌含量呈显著负相关（r=-0.980），可能是因为总酚与可溶性醌是相互转化的，总酚含量提高，醌含量就会降低；AA 处理后的莲藕汁总酚含量与PPO 酶活呈极显著负相关 （r=-0.992），PPO 酶活越高，总酚含量越低。PPO 酶活与可溶性醌含量、POD 酶呈显著正相关（r=0.987，r=0.961），说明PPO 与POD 在酶促褐变反应中起协同作用，可能是因为PPO 酶活越高，生成的可溶性醌含量越多。

表1 AA 处理莲藕汁酶促褐变指标的相关性分析Table 1 Correlation analysis of enzymatic browning of lotus rhizome juice treated with AA

2.2 不同浓度抗坏血酸处理对莲藕汁品质指标的影响

AA 处理对莲藕汁品质的影响如表2所示。数据分析结果表明，与对照组相比，处理组白度显著增加（P＜0.05）。随AA 浓度的增加，莲藕汁白度呈上升趋势，当AA 添加浓度为8 mmol/L 时，与对照组相比，白度增加了6.30%。添加AA 不会引起藕汁可溶性固形物含量发生显著变化 （P＞0.05），始终维持在6%左右，说明AA 的添加基本不影响藕汁中可溶性糖的含量。随着AA 浓度升高，莲藕汁黏度上升，pH 值下降。

AA 处理后莲藕汁中蛋白质含量有较大幅度的下降，可能有2 种原因：一方面可能是因为AA属于酸性化合物，随着浓度升高，酸性越强，越接近莲藕汁中蛋白质等电点，蛋白质分子相互间的作用力减弱，极易发生碰撞、凝聚而生成沉淀，因此含量下降，另一方面可能随着总酚含量的升高，酚类物质与蛋白质有更大机会发生相互作用而沉淀下来。蛋白质含量降低有利于减小后期藕汁贮藏过程中美拉德反应发生的可能性。

VC 是维持机体正常生理功能不可缺少的一类有机物[33]，是果蔬及其加工制品重要的品质特征。莲藕汁在加工过程中，不可避免会发生VC 氧化降解[34]，在加工过程中加入VC，不仅可以增加其含量，还可以抑制褐变。从表2可以看出，随着AA 添加量的增加，莲藕汁中VC 含量也在不断上升。当AA 添加量为8 mmol/L 时，莲藕汁的VC 含量达到0.439 mg/mL，比对照组提高了128.65%。

表2 莲藕汁品质指标Table 2 Quality indexes of lotus rhizome juice

不同浓度AA 处理的莲藕汁品质指标间的相关性如表3所示。由表可知，各指标之间存在良好的相关关系。AA 的浓度与藕汁白度呈极显著正相关（r=0.992），与pH 值呈极显著负相关（r=-0.995），与总蛋白含量呈显著负相关（r=-0.961），说明AA 浓度与藕汁白度、pH 值、蛋白质含量之间密切相关。AA 处理后的莲藕汁白度与可溶性固形物含量呈显著正相关（r=0.975），与pH 值、总蛋白含量呈显著负相关 （r=-0.975，r=-0.979）；可溶性固形物含量与总蛋白含量呈显著负相关（r=-0.976）；pH 值与VC 含量呈显著负相关（r=-0.952）。相关性分析结果表明，添加AA 改善了藕汁的理化性质及特征营养品质，其中AA 浓度和白度、pH 值的相关性最强，在研究范围内AA的添加显著改变了藕汁酸度，提高了藕汁白度（P＜0.01）。

表3 不同AA 处理莲藕汁品质指标的相关性分析Table 3 Correlation analysis of quality indexes of lotus rhizome juice treated by AA

为了探究添加AA 引起的品质特征改变是否与褐变指标的改变有关，本研究进一步探讨了褐变指标和品质指标间的相互关系，结果如表4所示。AA 处理的莲藕汁褐变度与黏度呈极显著负相关（r=-0.999），说明褐变度和黏度之间有密切关系，具体原因需要进一步探究。白度与总酚含量呈显著正相关，与可溶性醌含量、PPO 酶活、POD 酶活呈显著负相关，说明酶促褐变与藕汁的颜色密切相关。可溶性固形物与总酚含量呈显著正相关，与PPO 酶活呈显著负相关；pH 值与总酚含量呈显著正相关，与可溶性醌含量、PPO 酶活呈显著负相关，说明pH 值在酶促褐变过程中起重要作用，pH 值降低会抑制酶促褐变的发生。总蛋白含量与可溶性醌含量、PPO 酶活、POD 酶活呈显著正相关，说明蛋白质含量与可溶性醌含量、PPO 酶活和POD 酶活有密切联系，可能的原因是总蛋白含量对酶活有重要影响，并且蛋白质与醌也可能会发生一定程度的相互作用[35]。褐变度和白度的相关性为-0.799，说明白度除了受酶促褐变的影响，还受其它因素影响，例如：温度、pH 值和氧气等。这些结果表明AA 处理后的藕汁的品质特征与酶促褐变指标之间密切相关，酶促褐变中的3 个指标（总酚含量、可溶性醌含量、PPO 酶活）都与白度、pH 值有显著相关性，说明AA 的加入改变了pH值，进而影响了酶促褐变的发生，改善了产品的理化指标和特征营养品质。

表4 AA 处理的莲藕汁品质和酶促褐变指标的相关性分析Table 4 Correlation analysis of quality and enzymatic browning index of lotus rhizome juice treated with AA

3 结论

本研究测定了不同浓度AA 处理的莲藕汁酶促褐变与品质特征的变化，并对其进行了相关性分析。在莲藕汁酶促褐变方面，随着AA 浓度升高，莲藕汁总酚含量上升，褐变度、可溶性醌含量、PPO 酶活、POD 酶活下降。酶促褐变指标间的相关性分析发现AA 在莲藕汁酶促褐变中的作用主要分为2 个方面：一方面保护酚类不被氧化，还原褐变中间产物醌，提高总酚含量；另一方面，AA 抑制了PPO 和POD 酶活性。在莲藕汁品质特征分析方面，与对照组相比，随着AA 浓度升高，莲藕汁白度、黏度、VC 含量呈上升趋势，pH 值和蛋白质含量下降，可溶性固形物含量基本维持稳定。品质指标间的相关性分析发现AA 处理改善了藕汁的理化性质及特征营养品质。酶促褐变指标与品质特征参数之间的相关性分析发现pH 值和白度等莲藕汁品质指标的变化与其总酚含量、可溶性醌含量、PPO 酶活等酶促褐变参数的变化密切相关，说明AA 的加入使莲藕汁整体酸度下降，进而抑制了酶促褐变的发生，从而提高了莲藕汁的品质特征。综合来看，AA 处理的莲藕汁在抑制酶促褐变及维持品质特征方面优于对照组，在研究范围内AA 浓度越高，效果越好，而且酶促褐变和品质之间密切相关。