莲蓣消瘿汤对桥本甲状腺炎患者外周血中CD4+CD45RO+记忆性T细胞的影响*

刘曼曼，胡春平，冯珍凤，高俊凤，严 军

（1.上海市嘉定区中医医院，上海 201899；2.上海中医药大学，上海 201203）

桥本甲状腺炎（hashimoto's thyroiditis，HT），又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎，是一种自身免疫性疾病，以甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody，TPO-Ab）、甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody，TgAb）阳性为主要临床特征，且伴甲状腺不同程度的肿大，质地较硬[1]。本病起病隐匿，大部分患者经历数年后可由于甲状腺滤泡细胞的破坏，发展为甲状腺功能减退，对全身产生影响[2]。甚至有研究显示本病由于干扰免疫监视，可诱发免疫逃逸，与恶性甲状腺肿瘤有一定的联系[3-4]。西医目前尚无针对本病病因的治疗方法，一旦出现甲状腺功能减退和亚临床甲状腺功能减退则须终身服用甲状腺素，有文献报道[5]补硒治疗可以降低患者血清TPO-Ab和TgAb阳性率，但尚缺乏大规模循证医学证据支持。目前的研究已证实，HT的发生发展过程中有多种免疫细胞及细胞因子共同参与，而自身反应性T细胞的激活在HT的病程进展中起关键作用[6]。研究[7]表明，CD4+CD45RO+记忆性T细胞在HT患者中显著升高，CD4+CD45RO+记忆性T细胞可通过调节IFN-γ、IL-17分泌干预HT的疾病进展。莲蓣消瘿汤是上海市嘉定区中医医院内分泌科治疗桥本甲状腺炎的经验方，前期研究证实此方可有效改善HT患者临床症状，降低HT患者TPO-Ab、TgAb滴度，但相关机制尚未明确。为此，笔者团队选用本院132例甲状腺功能正常的HT患者，检测外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞水平，探讨莲蓣消瘿汤治疗HT相关作用机制。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准 符合桥本甲状腺炎的诊断标准[8]：（1）凡是弥漫性甲状腺肿大，质地较韧，特别是伴峡部锥体叶肿大，不论甲状腺功能是否改变，均应怀疑HT；（2）血清TPO-Ab和TgAb检测呈阳性；（3）甲状腺细针穿刺和细胞学检查（FNAC）显示桥本甲状腺炎。甲状腺功能指标正常范围内，符合（1）和（2）或单独具备（3）都可确认诊断成立。

1.1.2 中医辨证标准 根据《中药新药临床研究指导原则（试行）》[9]中瘿病诊断标准制定肝郁脾虚证辨证标准。（1）主症：颈前不适或肿大，触痛，烦躁易怒，疲劳乏力；（2）次症：口干，口渴，健忘，纳呆腹胀，便秘或排便无力或便溏不爽，月经紊乱；（3）舌脉：舌淡红苔薄白，舌体胖大或边有齿痕，脉弦或细弱。舌象、脉象结合主症加2项或以上次症即可确立辨证。

1.2 纳入标准（1）符合上述西医、中医诊断标准；（2）年龄18～50岁，性别不限；（3）近1个月未接受过中药制剂等治疗。

1.3 排除标准（1）年龄＜18岁或≥50岁；（2）妊娠或哺乳期妇女；（3）对本药过敏者；（4）合并甲状腺功能亢进或甲状腺功能减退者；（5）甲状腺肿大明显压迫邻近器官或伴有突眼者；（6）有严重的心、肝、脑、肾和造血系统及代谢性疾病，或伴有其他免疫性疾病，或合并精神疾病及抑郁症的患者；（7）依从性差、中途退出及资料不全者。

1.4 研究对象 本研究通过上海市嘉定区中医医院伦理审查（嘉定区中医医院2017年伦理审查004号）。选取2017年1月至2019年7月在上海市嘉定区中医医院内分泌门诊就诊符合西医及中医诊断标准甲状腺功能正常的肝郁脾虚证桥本甲状腺炎患者132例。将纳入病例随机分为中药组、西药组及中药联合西药组（联合组），每组44例。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组 予硒酵母片[5]（商品名：西维尔；牡丹江灵泰药业股份有限公司，50 μg/片）治疗，餐后半小时口服，早晚各口服1次，2片/次。疗程12周。

1.5.2 中药组 予莲蓣消瘿汤，由本院药剂科统一煎制，150 mL/包，方药组成：柴胡6 g，香附10 g，郁金15 g，白芍15 g，麸炒白术12 g，白茯苓15 g，法半夏10 g，浙贝母10 g，穿山龙30 g，白花蛇舌草30 g，重楼10 g，半枝莲15 g，生甘草6 g。餐后半小时口服，150 mL/次，早晚各1次。疗程12周。

1.5.3 联合组 予莲蓣消瘿汤和硒酵母片口服，剂量和方法同“对照组”及“中药组”。疗程12周。

1.6 观察指标

1.6.1 一般项目 姓名、性别、年龄、病程、伴随疾病及一般体格检查（体温、血压、心率、呼吸、脉搏）等。

1.6.2 甲状腺功能及相关因子 研究对象禁食8 h后抽取静脉血10 mL，3 000 r/min离心分离血清，-20℃保存血清备用，采用化学发光免疫法（德国罗氏公司，Cobas6000型）测定游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）、促甲状腺素（TSH）、TPO-Ab、TgAb；酶联免疫吸附法（ELISA试剂盒由中国博士德生物工程有限公司提供）测定血清白细胞介素-17（IL-17）、干扰素-γ（IFN-γ）表达量；收集离心后下层血细胞采用流式细胞分析仪（美国BD公司，FACS Calibur型）测定CD4+CD45RO+记忆性T细胞在外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的百分比。标本处理时间在采血后4 h以内完成。

1.7 统计学方法 采用SPSS 21.0进行统计分析。计量资料用（±s）表示，符合正态分布和方差齐性，治疗前后对比采用配对t检验，3组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布和方差齐性者采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基线资料 由于患者依从性原因造成失访12例（中药组4例，西药组4例，联合组4例），失访率9.10%（12/132），最终完成120例。3组患者基线资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。（见表1）

表1 3组患者基线资料比较

2.2 甲状腺功能及TPO-Ab、TgAb检测结果

2.2.1 3组患者甲状腺功能比较3组患者治疗前FT3、FT4、TSH比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。治疗后3组患者FT3、FT4、TSH与治疗前比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；治疗后3组患者FT3、FT4、TSH比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 3组患者甲状腺功能比较（±s）

表2 3组患者甲状腺功能比较（±s）

FT3（pg/mL） FT4（ng/mL） TSH（μIU/mL）治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P联合组40 3.12±0.61 2.99±0.33 0.845 0.405 1.24±0.41 1.09±0.24 1.653 0.109 2.34±1.14 2.49±0.77-0.686 0.498中药组40 3.01±0.51 2.96±0.37 0.392 0.698 1.08±0.40 1.05±0.31 0.287 0.777 2.60±1.17 2.28±0.73 1.338 0.192西药组40 2.97±0.62 2.94±0.34 0.309 0.760 1.06±0.48 0.93±0.30 1.123 0.271 2.59±1.16 2.06±0.80 0.182 0.857 F 0.511 0.277 1.405 2.581 0.474 0.949 P 0.602 0.759 0.251 0.082 0.624 0.391组别 例数

2.2.2 3组患者甲状腺抗体比较3组患者治疗前TPO-Ab、TgAb比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。与治疗前比较，3组患者治疗后TPO-Ab、TgAb均降低，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。治疗后组间比较，联合组、中药组优于西药组（P＜0.01），联合组优于中药组（P＜0.05）。（见表3）

表3 3组患者甲状腺抗体比较（±s）

表3 3组患者甲状腺抗体比较（±s）

注：与西药组比较，aP＜0.01；与中药组比较，bP＜0.05

TPO-Ab（IU/mL） TgAb（IU/mL）治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P联合组 40 723.52±199.47 245.89±117.85a b 15.171 0.000 503.64±176.34 177.10±80.89a b 13.052 0.000中药组40 714.12±205.35 399.45±108.38a 11.200 0.000 509.35±156.52 236.82±87.07a 14.471 0.000西药组40 726.33±128.28 582.19±166.41 7.900 0.047 512.89±120.57 390.86±99.77 7.462 0.049 F 0.035 45.511 0.015 43.049 P 0.966 0.000 0.985 0.000组别 例数

2.3 血清IL-17、血清IFN-γ、外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞检测结果

2.3.1 3组患者血清IL-17、IFN-γ比较3组患者治疗前血清IL-17、IFN-γ比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。与治疗前比较，联合组、中药组患者治疗后血清IL-17、IFN-γ均显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）；西药组患者治疗后血清IL-17、IFN-γ与治疗前比较有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后组间比较，联合组、中药组患者血清IL-17、IFN-γ均低于西药组（P＜0.01）；联合组患者血清IL-17、IFN-γ均低于中药组（P＜0.05）。（见表4）

表4 3组患者血清IL-17、IFN-γ比较（±s，pg/mL）

表4 3组患者血清IL-17、IFN-γ比较（±s，pg/mL）

注：与西药组比较，aP＜0.01；与中药组比较，bP＜0.05

IL-17 IFN-γ治疗前 治疗后 t P 治疗前 治疗后 t P联合组40 15.57±9.01 6.62±3.16ab 18.705 0.000 16.23±8.27 3.24±2.13ab 27.181 0.000中药组40 14.71±8.40 9.98±4.90a 8.992 0.000 17.09±9.24 6.12±3.94a 26.370 0.000西药组40 15.35±8.21 13.09±5.27 2.793 0.064 16.12±9.44 13.92±5.89 2.942 0.058 F 0.475 17.278 0.524 13.215 P 0.631 0.000 0.648 0.000组别 例数

2.3.2 3组患者外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞在PBMC中百分比比较3组患者治疗前外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞在PBMC中百分比比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。与治疗前比较，联合组、中药组患者治疗后外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞在PBMC中的百分比显著降低（P＜0.01），西药组患者治疗后外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞在PBMC中的百分比与治疗前比较有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05)；治疗后组间比较，联合组、中药组患者CD4+CD45RO+记忆性T细胞在PBMC中的百分比明显低于西药组，差异有统计学意义（P＜0.01）；联合组低于中药组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表5）

表5 3组患者外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞在PBMC中百分比比较（±s）

表5 3组患者外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞在PBMC中百分比比较（±s）

注：与西药组比较，aP＜0.01，bP＞0.05

组别 例数 治疗前 治疗后 t P联合组 40 29.52±6.62药组40 28.91±5.93药组40 29.04±6.25 20.98±4.12ab 11.975 0.000中 22.63±5.46a 8.790 0.000西 26.87±3.07 2.236 0.069 F 1.217 24.378 P 0.348 0.000

3 讨 论

HT已成为临床上最常见的自身免疫性疾病，患病率近8/1 000，男、女患病比例为1∶8，以中青年女性居多[10]。研究发现[11]，随着病情发展，大部分患者最终会变成甲状腺功能减退，同时由于自身免疫缺陷的影响，会出现甲状腺结节、突眼、怕冷、疲乏、便秘等症状。此外，HT严重影响女性生殖健康，易导致甲状腺乳头状癌[3]及其他自身免疫性疾病的发生，严重危害生命健康，降低生活质量，故甲状腺功能正常HT的发病机制及如何阻止该疾病进一步发展已成为目前的研究热点。

HT发病是由于机体免疫耐受打破及过度甲状腺免疫反应造成。甲状腺自身免疫破坏过程中多种免疫细胞及细胞因子共同参与了HT的发生发展，其中自身反应性T细胞的激活是HT发病的关键[6]。记忆性T细胞由初始T细胞于外周淋巴器官内接受抗原提呈细胞所提呈的抗原后活化直接分化而成，或由效应T细胞转化而来，记忆性T细胞与自身反应性T细胞可以相互转化。CD45RO分子是记忆性T细胞的表面标志，在外周血中，自身反应性T细胞在接触抗原被活化后，细胞膜表面CD45RO分子表达增强，进一步增强免疫反应[12]，最新的研究发现其参与了系统性红斑狼疮等诸多自身免疫性疾病的发生发展[13]。IFN-γ是由CD4+T细胞的辅助性T1细胞亚群产生的促炎细胞因子，参与炎症和甲状腺疾病的发展，与甲状腺功能减退等免疫系统疾病相关[14]。IL-17是CD4+T细胞的独特谱系，主要由Th17分泌，LI D P等[15]发现HT的初诊患者中，其局部甲状腺组织的IL-17蛋白表达及血清IL-17的水平均明显高于正常人，进一步证实了IL-17与HT的病程密切相关。马倩倩[7]研究发现，HT患者CD4+CD45RO+记忆性T细胞及IFN-γ、IL-17水平显著高于正常人群，且HT患者外周血CD4+CD45RO+记忆性T细胞水平与IL-17、IFN-γ、TPO-Ab、TgAb的表达量呈正相关，CD4+CD45RO+记忆性T细胞占PBMC的比例越高，IFN-γ、IL-17水平则越高，进一步提示CD4+CD45RO+记忆性T细胞通过调节IFN-γ、IL-17等参与HT的发展。

近年来，中医药在治疗桥本甲状腺炎方面显示出独特的优越性[16-18]，中医学关于甲状腺疾病的记载主要归于“瘿病”范畴。《诸病源候论》曰：“诸山水黑土中，出泉流者，不可久居，常食令人作瘿，动气增患”；“瘿者，由忧患气结所生”。指出瘿病的病因主要是情志内伤、饮食水土失宜及体质因素。纵观文献，本病初期以气滞、痰凝为主，日久则肝脾失调，痰瘀互结，最终气、痰、血相互搏结于颈前。而女子以肝为先天，以血为用，妇女的经、孕、产、乳与肝经气血密切相关，故遇情志因素，常气郁痰结，气滞血瘀，这亦是女性更易患此病的原因，故肝郁气滞为本病发病关键，正如王德双等[19]对60例新诊断HT患者观察发现肝郁者占81.67%。王小龙等[20]对HT在内的甲状腺疾病体质学调查表明气郁质是主要的体质类型或主要的兼夹体质类型。而肝郁日久，木旺乘土，肝郁一分，脾虚一分，如影随形，日久交结，津液运行受阻，津凝痰聚，痰气搏结颈前，日久血脉瘀阻，终致气、痰、瘀合而为患。另从经脉循行部位而言，足厥阴肝经“循喉咙之后，上入颃颡”，足太阴脾经“上膈，挟咽，连舌本，散舌下”，肝经、脾经均经过甲状腺所处喉咽附近，与甲状腺密切相关。莲蓣消瘿汤为我院严军根据HT病机结合临床经验总结出的治疗肝郁脾虚证甲状腺功能正常桥本甲状腺炎的验方。方中柴胡、香附、郁金同用，疏肝解郁行气之效显著；白芍柔肝养肝，理气而不伤阴；麸炒白术、白茯苓健脾化痰，以杜绝生痰之源；法半夏、穿山龙、浙贝母化痰散结消肿；生甘草调和诸药；因“重阴之下，必有伏阳”，加重楼、半枝莲、白花蛇舌草以“清热”贯穿始终。全方行气以助肝用，甘柔以润肝体，体足则用强，气无滞涩之弊。健脾助运，游溢水液，水无停滞则痰涎不生。“气增而久，夭之由也”，虽然HT大法以散结为主，但在整体观、运动观的思想指导下，不能不兼顾长期使用香燥之品带来的伤阴和助热的弊端，因此运用清热散结之品，清中有散。“气有余便是火”，邪热内生，更灼伤水液，炼津为痰，痰热互结，壅滞更甚，清热利于散结，散结有助清热。诸药合用，气体得畅，津液得布，蕴结自开。

本研究结果表明，莲蓣消瘿汤可有效降低HT患者TPO-Ab、TgAb抗体，并可降低血清IL-17、IFN-γ的表达量及CD4+CD45RO+记忆性T细胞在PBMC所占的比例，而西药组未见明显优势，提示莲蓣消瘿汤可能通过下调肝郁脾虚证HT患者体内CD4+CD45RO+记忆性T细胞水平，降低血清IL-17、IFN-γ的表达量，调节机体免疫功能进而延缓HT的病程进展。但由于随访时间短，样本量较小，CD4+CD45RO+记忆性T细胞与HT发病机制尚未完全明确，今后应进行更大样本量的研究及延长随访时间，对其之间的联系进行深入研究。