UPLC-MS/MS法测定炮制前后款冬花中款冬碱的含量

昝 珂 李耀磊 王丹丹 金红宇 马双成 刘丽娜* 王 莹*

1.中国食品药品检定研究院，北京 102629；2. 北京中医药大学中药学院，北京 102488

款冬花为菊科植物款冬(TussilagofarfaraL.)的干燥花蕾，别名冬花，主要分布于甘肃、陕西、山西及河南等地区[1]。现代临床多用于新久咳嗽，喘咳痰多，劳嗽咳血的治疗，疗效显著。临床多用蜜炙品(蜜款冬花)，中医认为，蜂蜜炮制款冬花能够增强止咳化痰、润肺下气的功效[2]。款冬花中含有吡咯里西啶生物碱类成分，款冬碱是从款冬花中分离得到的一种吡咯里西啶生物碱类成分[3]。1,2-不饱和的吡咯里西啶生物碱具有肝毒性，但款冬碱是饱和的吡咯里西啶生物碱(结构式见图1)，不具有肝毒性[4]。吡咯里西啶生物碱类成分往往具有抗菌、抗胆碱等药理作用[5]。款冬碱至今仅在少数几个植物中有报道[6]，具有较强的专属性，含量测定至今未见报道。本文建立UPLC-MS/MS法，同时测定蜜炙前后的款冬花中款冬碱的含量，对其炮制前后含量的变化进行比较。

图1 款冬碱的结构式

1 仪器与材料

H-CLASS超高效液相色谱仪(沃特世)；三重四极杆串联质谱检测器(沃特世)；R-210型旋转蒸发仪(Buchi公司)；KQ-3200DV型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Quintix125D-1CN电子分析天平(赛多利斯公司)。Oasis MCX固相萃取小柱(150 mg/6 cc，沃特世公司)。

对照品款冬碱(批号：11782)由上海钦诚生物科技有限公司提供；纯度大于98%；乙腈、甲醇、甲酸和甲酸铵均为质谱级(Fisher)，屈臣氏超纯水，其他试剂为分析纯。

款冬花采自甘肃省，经中检院昝珂副研究员鉴定为菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾。每批样品分为2份，一份为生品(编号分别标记为S1～S4)，另一份按照《中国药典》通则规定，照蜜炙法用蜜水炒至不粘手(编号分别标记为Z1～Z4)。

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件 色谱柱：Waters CORTECS UPLC C18(100 mm × 2.1 mm, 1.6 μm)；柱温：40 ℃；流动相：0.05%甲酸水溶液(A)及含0.05%甲酸的乙腈(B)(4∶1)；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：2 μL。质谱离子源为电喷雾离子化源(ESI)；正离子多反应监测模式(MRM)；毛细管电压3.0 kV；离子源温度150 ℃；去溶剂温度500 ℃。款冬碱对照品溶液进样后得到准分子离子峰m/z200.20[M+H]+(图2)；准分子离子峰经子离子扫描，得到主要碎片为m/z57.03和m/z83.18(图3)，选定m/z57.03为定量离子，m/z83.18为定性离子。经手动优化锥孔电压和碰撞电压，锥孔电压为24 V，定量离子碰撞电压为30 V，定性离子碰撞电压为36 V。对照品及样品的色谱图如图4所示。

图2 款冬碱正离子模式下质谱图

图3 款冬碱正离子模式下子离子扫描质谱图

图4 对照品溶液(A)和供试品溶液(B)MRM色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取款冬碱适量，用10%乙腈水溶解配成浓度分别为1.005 μg·mL-1的对照品储备液。精密量取对照品储备液适量，用10%乙腈水配成浓度为20.10 ng·mL-1的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取款冬花粉末1.0 g，精密称定，加入 0.05 mol·L-1硫酸溶液40 mL，超声提取 (300 W， 40 kHz)30 min，过滤，取滤液20 mL进行固相萃取富集纯化。具体流程为甲醇5 mL活化SPE-PCX小柱，0.05 mol·L-1硫酸溶液5 mL平衡小柱，将硫酸溶液样品20 mL上柱，甲醇10 mL淋洗除杂， 8%氨水-甲醇溶液10 mL洗脱，收集洗脱液并浓缩至1 mL左右，用10%乙腈水稀释定容至100 mL量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系和灵敏度考察 分别精密吸取对照品储备液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mL，置100 mL量瓶中，加10%乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，按照“2.1”项下的条件进行测定。以对照品的峰面积为Y，对应的浓度为X进行线性回归。款冬碱的回归方程为Y= 23621X-1876，相关系数r=0.9993，表明款冬碱的线性关系良好。以定量离子对的色谱峰信噪比S/N≥3对应的最低浓度为检测限(LOD)，以定量离子对色谱峰信噪比S/N≥10对应的最低浓度为定量限(LOQ)，检测限为0.10 ng·mL-1， 定量限为0.30 ng·mL-1。

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液1 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果款冬碱的峰面积的RSD为2.35%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液(S1)，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果款冬碱的峰面积的RSD (n=6)为2.62%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 重复性试验 按照“2.2.2”项下方法制备样品(S1)溶液6份，分别进样测定。结果款冬碱的平均含量分别为20.76 μg·g-1，RSD (n=6)为2.87%，表明该方法的重复性良好。

2.3.5 加样回收试验 取款冬碱对照品适量，精密称定，置量瓶中，加10%乙腈水溶解配制成质量浓度分别为10.05 μg·mL-1的对照品溶液。取已知含量的供试品粉末(S1)6份，每份各约0.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入上述对照品溶液各1.0 mL，按照“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，进样分析，计算回收率。结果见表1。

表1 款冬碱加样回收试验结果

2.4 含量测定 分别准确称取不同产地的款冬花药材1.0 g，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，依据外标法计算款冬碱的含量。结果见表2。

表2 款冬花炮制前后款冬碱的含量测定结果 (μg·g-1, n=2)

3 讨论

3.1 检测方法的选择 款冬碱为款冬花中特征性的吡咯里西啶生物碱类成分，为痕量成分，采用高灵敏度的UPLC-MS/MS法为首选方法。本实验采用UPLC-MS/MS法同时测定，正离子多反应监测被测成分的离子对，灵敏度高，定量离子峰形好，其他物质无干扰，能够对待测物质准确测定。

3.2 流动相的选择 本研究考察了不同配比乙腈-水以及含有甲酸、甲酸铵等含酸溶液作为流动相对吡咯里西啶生物碱的分离能力的影响。通过调节流动相比例，通过预实验最终确定流动相为含0.05%甲酸的水溶液及含0.05%甲酸的乙腈(4∶1)恒流洗脱，在该系统下能够对款冬碱达到定量测定的要求。

3.3 定量分析结果 本文采用建立的UPLC-MS/MS法对炮制前后款冬花中的款冬碱的含量进行的测定，炮制对款冬花中款冬碱的含量具有明显影响，炮制后款冬碱呈明显的下降趋势，下降的成分是否转化为其他物质需要进一步研究。