蜂房栓剂制备工艺及抑痔药效学研究

王绍仙 赵若丹 王 莹 王玉新 陈旭冰

大理大学药学院，云南 大理 671000

痔疮是直肠下端的肛垫出现病理性肥大的表现，民间常说“十人九痔”，可见痔疮是一种常见病，其临床表现为局部炎症、水肿、疼痛、糜烂、便血，甚则脱肛[1-2]。在痔疮的诸多治疗方法中，局部给药能直接作用于发病部位，更好地发挥药效，是一种较理想的给药途径，其中以栓剂应用最为广泛。栓剂对初期内痔及二、三期内痔有止血、止痛、收敛、消炎等作用，对全身症状和直肠炎症也有治疗作用。蜂房是胡蜂的巢，《本草纲目》、《本草纲目彩色药图》记载，蜂房具有祛风、攻毒、杀虫、止痛的功效，可以治疗痔疮[3-4], 《神农本草经》也记载，蜂房能治肠痔。现代研究[5]发现，蜂房中含有黄酮类化合物，黄酮类化合物具有抗炎的作用，为古籍疗法提供了一定的科学依据。为了探讨蜂房对痔疮的治疗作用，本文将蜂房提取物制成栓剂，并进行了药效学评价。

1 材料与仪器

1.1 材料 金环胡蜂蜂房购自云南省大理市下关镇，经云南省昆虫生物医药研发重点实验室杨自忠教授鉴定为膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespidae)胡蜂属(Polistes)昆虫金环胡蜂Vespa mandarinia Smith的蜂房。乙醇为国产分析纯，水为蒸馏水，芦丁标准品(批号：100080-200707，中国药品生物制品检定所)，混合脂肪酸甘油酯(批号：20160928，上海源叶生物科技有限公司)。

1.2 仪器 R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)，JY2002电子天平(上海精其仪器有限公司)，METTLER TOLEDO分析天平(上海梅特勒—托利多仪器有限公司)，HWS-12型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)，DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)，摇摆式中药粉碎机(上海烨昌食品机械有限公司)。

2 栓剂的制备

2.1 浸膏的制备 取金环胡蜂蜂房(如图1所示)1000 g，加入3000 mL 50%乙醇加热回流提取2 h，提取液经棉花过滤后用旋转蒸发仪减压浓缩后得浸膏，将浸膏置于电热恒温鼓风干燥箱内在70℃条件下烘4 h，恒重，得浸膏100 g，研磨，过80目筛，备用。

图1 金环胡蜂蜂房

2.2 总黄酮含量的测定

2.2.1 芦丁标准品溶液的制备 精密称取0.0106 g芦丁，加入适量50%乙醇完全溶解后转移至25 mL的棕色容量瓶中，定容，备用。

2.2.2 显色方法 取待测样品溶液1 mL于l0 mL比色管中，加50%乙醇定容至2.0 mL。加入5%的亚硝酸钠溶液0.5 mL，混匀，静置6 min后加入10%的硝酸铝溶液0.5 mL，混匀，静置6 min后再加入4%的氢氧化钠溶液4.0 mL，用50%的乙醇定容，静置15 min后测定吸光度。取1 mL 50%乙醇溶液作为待测样品按上述操作配制空白对照溶液[5]。

2.2.3 标准曲线绘制 分别取芦丁标准品0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，按上述显色方法显色后，在360 nm波长处测定吸光度值。每个样品重复操作3次取平均值，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线[5]。

2.2.4 总黄酮含量的测定 取0.02 g浸膏溶于10 mL甲醇溶液中，取1 mL溶液按上述操作步骤测定吸光度值，测3次取平均值，将吸光度值带入回归方程，得到总黄酮的浓度，计算出总黄酮的含量为0.39 mg/g。

2.3 主药剂量确定 露蜂房浸膏粉在每枚栓中的含量根据总黄酮的含量和临床栓剂质量确定。

2.4 栓剂的制备

2.4.1 纯基质栓的制备 将10 g混合脂肪酸甘油酯置于蒸发皿中，70 ℃条件下水浴加热至熔化，灌入涂有液体石蜡油的栓模中，静置凝固，削去溢出部分，启模(如图2所示)，选取5枚称重分别为0.98、0.95、0.96、0.94、0.97 g，平均栓重G为0.96 g。

图2 纯基质栓

2.4.2 含药栓的制备 将混合脂肪酸甘油酯置于蒸发皿中，70 ℃条件下水浴加热至熔化，再加露蜂房浸膏粉，灌入涂有液体石蜡油的栓模中，静置凝固，削去溢出部分，启模(如图3所示)，选取5枚称重分别为1.24、1.23、1.21、1.22、1.20 g，平均栓重M为1.22。

图3 蜂房栓

2.4.3 计算置换价 根据公式DV=W/[G-(M-W)]计算置换价，W为一枚含药栓中的平均含药质量，经计算置换价为1.62。

2.4.4 处方最大含药量确定 称取3份20 g混合脂肪酸甘油酯于70℃条件下水浴加热至熔化，分别加入5 g、10 g和15 g露蜂房浸膏粉，灌入涂有液体石蜡油的栓模中，静置凝固，削去溢出部分，启模，分别得到含主药20%、33%和43%的栓剂。以外观、成型和硬度为指标进行评价，选择最大含药量为33%。

2.4.5 融变时限 将自制蜂房栓3枚，分别置于融变仪中测定融变时限。3枚蜂房栓均在(22±2)内融化、软化，符合油脂性基质要求。

3 蜂房栓对痔疮的作用

3.1 材料

3.1.1 实验动物 SD大鼠，6周龄，SPF级，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：S(湘)2016-0002。25 ℃室温喂养，给予大鼠专用标准饲料、纯净水，自由取食饮水，所有实验研究均符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。

3.1.2 药品及试剂 IL-1β试剂盒(批号：20170901)、IL-6 试剂盒(批号：20170901)、TNF-α试剂盒(批号：20170901)、iNOS试剂盒(批号：20170901)等均购自南京建成生物工程研究所。

3.2 方法

3.2.1 分组 50只大鼠按随机数字表随机分为空白组、模型组、治疗组高、低剂量组和阳性药组(消炎痛栓组)，每组10只。

3.2.2 造模 空白组大鼠未处理，其余组用水合氯醛行腹腔麻醉。模型组和实验组均用浸吸巴豆油混合液的棉球插入麻醉后的大鼠肚门内，将大鼠头朝上提起直立，10 s后拔出[6]。

3.2.3 给药 阳性对照组和受试药组分别给予消炎痛栓和蜂房栓剂，加热融化后，按大鼠重量制成小块纳入大鼠肛门，并用胶布固定。除空白组和模型组外，其余组于造模6 h后开始给药，共给药2次，每次间隔6 h。末次给药6 h后，动物处死取肛周组织。

3.2.4 取材 实验结束后，处死实验动物，以棉签插入肛门为指引，沿肛周0.5 cm环形分离肚门，深至直肠上1.0～1.5 cm，剪断肠管，冰浴上充分研磨，离心后取其上清液移至管中放入冰箱保存。

3.3 结果

3.3.1 肛周组织形态改变 空白组大鼠肛门回缩，无水肿等异常情况；模型组大鼠肛周组可见红肿，大量分泌物，偶见轻度糜烂，未见出血点。阳性药组大鼠肛周组织仍有轻度红肿，但无分泌物、糜烂和出血。蜂房栓剂低剂量组大鼠肛周组中度红肿，有少量分泌物，无出血和糜烂。蜂房栓剂高剂量组大鼠肛周组轻度红肿，有少量分泌物，无出血和糜烂。如表1。

表1 蜂房栓剂对肛周组织形态的影响

3.3.2 蜂房栓剂对TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS含量的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β及iNOS含量显著升高(P<0.01)。与模型对照组相比，阳性组大鼠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS含量显著降低 (P<0.01)，低剂量组除iNOS含量显著降低外(P<0.01)，对其它炎症因子无明显影响，高剂量组显著降低组织中TNF-α、IL-6、IL-1β及iNOS含量(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。

表2 蜂房栓剂对肛周及直肠组织中炎症因子的影响

4 讨论

栓剂形式给药既可以避免胃酸和消化道酶对药物的破坏，又可以避免药物对胃黏膜的刺激，同时能直接作用于病灶部位而迅速发挥作用，提高患者的生活质量，栓剂在腔道给药中尤其具有优势[7]。栓剂的制备过程中，基质的选择尤为重要，在预实验时分别选用水溶性基质聚乙二醇(PEG)和脂溶性基质混合脂肪酸甘油酯为栓剂基质，以外观、成型和硬度为指标进行评价，发现混合脂肪酸甘油酯为基质制备的栓剂优于聚乙二醇为基质制备的栓剂，因此选择混合脂肪酸甘油酯为栓剂基质。民间常用蜂房喂牛、马等牲畜来预防疾病。《本草纲目》记载，蜂房可以治疗痔疮，但对其抑痔作用的药效学研究未见报道。为进一步深入挖掘蜂房的药用价值，本研究将蜂房提取物制成栓剂，并进行了初步的药效学评价，发现蜂房栓剂明显减轻痔周组织的炎症反应，模型动物肛周红肿范围明显缩小，分泌物减少，炎症因子显著降低，结果证明蜂房栓剂对痔疮有一定的治疗作用，在治疗痔疮上具有开发价值。另有报道称其药效作用物质可能为黄酮类化合物[5，8]，蜂房药效物质基础至今仍不明确，还需进一步研究。