金钱胆通颗粒质量标准提升研究

彭政忠 唐靖雯 潘 梅 杨 桃 潘 婷 卢礼平 王 欢

贵州威门药业股份有限公司，贵州 贵阳 550018

金钱胆通颗粒是由贵州威门药业股份有限公司生产的全国独家剂型专利品种，由连钱草、金钱草、茵陈、虎杖、柴胡、蒲公英、醋香附、丹参、决明子、乌梅10味中药组成。具有清利湿热、疏通肝胆、止痛排石的功效，用于胆石症湿热郁结于少阳胆附之胁痛。痛在右胁，固定不移，或继发绞痛，上引肩背、便秘尿黄，甚至身目俱黄发热，舌质暗红，苔厚腻或黄腻，脉弦滑或弦紧。金钱胆通颗粒批准文号为国药准字Z20163050，现行标准为国家药品标准YBZ00252016[1]；现收载于《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录(2019年版)》、《国家基本药物目录(2018版)》、《国家基本药物临床应用指南(2018年版)》。现行标准中薄层鉴别、含量测定方法专属性、重复性较差，不能有效控制产品质量。本研究在现行质量标准基础上，优化了金钱草、茵陈、虎杖、决明子、丹参、柴胡薄层鉴别方法，增加了以虎杖苷为指标性成分的含量测定方法。研究后建立的方法简便易行、专属性强、重复性好，可为该制剂质量标准的提升提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20AD高效液相色谱仪(PDA检测器)；ZF-2型三用紫外仪(上海市安亭电子仪器厂)；CH-250型超声波清洗机(天津恒奥科技公司)；；AG135型电子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 材料 金钱草对照药材(批号：121187-201403)、茵陈对照药材(批号：121555-201602)、虎杖对照药材(批号：120980-201706)、丹酚酸B对照品(批号：111562-201716)、橙黄决明素对照品(批号：111900-201605)、虎杖苷对照品(批号：111575-201603；纯度：87.3%；批号：111575-200502)均购于中国食品药品检定研究院；柴胡皂苷b2对照品(批号：7383，上海诗丹德标准技术服务有限公司)。硅胶G板(批号：20150701，青岛海洋化工厂分厂)，娃哈哈纯净水，乙腈(ACN)是色谱纯，其它试剂均为分析纯。

金钱胆通颗粒(批号：190302、190303、190402、190501、190801、190802、190804、190901、190902、190903)，由贵州威门药业股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别 在现行标准YBZ00252016的基础上进行了金钱胆通颗粒质量标准提高研究，对处方中的金钱草、茵陈、虎杖、决明子、丹参、柴胡薄层鉴别进行了修订，优化了金钱草薄层鉴别的供试品制备方法，采用超声法替代冷浸法，并采用过柱除杂，既提高检验效率又提高了相应斑点的清晰度，如图1A所示；优化了茵陈薄层鉴别的供试品制备方法，并用常规试剂二氯甲烷替代易制毒试剂三氯甲烷，提高了方法的专属性，如图1B所示；优化了虎杖的薄层鉴别方法，用虎杖对照药材、虎杖苷为对照，建立了虎杖专属鉴别项，如图1C所示；优化了决明子的薄层鉴别方法，用橙黄决明素为对照，建立了决明子专属鉴别项，如图1D所示；优化了丹参的薄层鉴别方法，删除了以原儿茶醛、丹参对照药材为对照的丹参鉴别项，建立以丹酚酸B为对照的丹参薄层鉴别，提高了方法的专属性，如图1E所示；优化了柴胡薄层鉴别的供试品制备方法，用常规试剂二氯甲烷替代易制毒试剂三氯甲烷，删除了柴胡对照药材，建立以柴胡皂苷b2 为对照的柴胡薄层鉴别，提高了方法的专属性。如图1F所示。

A：1～3.供试品溶液；4.阴性样品溶液；5.金钱草对照药材溶液。B：1～3.供试品溶液；4.阴性样品溶液；5.茵陈对照药材溶液。C：1～3.供试品溶液；4.阴性样品溶液；5.虎杖对照药材溶液；6.虎杖苷对照品溶液。D：1～3.供试品溶液；4.阴性样品溶液；5.橙黄决明素对照品溶液。E：1～3.供试品溶液；4.阴性样品溶液；5.丹酚酸B对照品溶液。F：1～3.供试品溶液；4.阴性样品溶液；5.柴胡皂苷b2对照品溶液。图1 金钱胆通颗粒薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A、B分别为乙腈、0.1%磷酸溶液，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；检测波长：306 nm；理论板数按虎杖苷峰计算不得低于3000。

表1 流动相梯度洗脱

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液 取虎杖苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。

2.2.2.2 供试品溶液 取金钱胆通颗粒(批号：190303)适量，混匀，研细，取约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W、频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.3 缺虎杖的阴性样品溶液 按处方量称取缺虎杖的群药，按照制备工艺的提取方法，制成阴性样品，再按“2.2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.2.3 专属性试验 取“2.2.2”项下对照品溶液、供试品溶液、缺虎杖的阴性样品溶液各10 μL，测定。结果显示，阴性样品无干扰。如图2所示。

A.供试品溶液；B.对照品溶液；C.缺虎杖的阴性样品图2 金钱胆通颗粒专属性试验HPLC图

2.2.4 线性关系考察 精密称取虎杖苷对照品15.34 mg(批号：111575-200502，纯度以89.5%计)，置于100 mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1373 mg/mL的对照品贮备液。分别精密吸取对照品储备液1、3、4、5、12、25 mL置于50 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，分别制成2.746、8.238、10.98、13.73、32.95、68.65 μg/mL系列浓度溶液，各进样10 μL，测定峰面积。以虎杖苷进样量(μg)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y=4194351.38x-5277.46(r=1.0000，n=6)。结果表明：虎杖苷在0.02746～0.6865 μg范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取浓度为13.61 μg/mL的虎杖苷对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果：峰面积的RSD为0.1%(n=6)，表明本方法精密度较好。

2.2.6 稳定性试验 取“2.2.2.2”项下方法制备的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分析，分别在0、2、4、8、12、18、24 h测定，记录色谱峰。结果：峰面积的RSD为0.3%(n=7)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批号样品(批号：190303)6份，按“2.2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，以外标一点法计算虎杖苷的含量。结果：样品中虎杖苷平均含量为1.292 mg/g，RSD为0.1%(n=6)，表明本方法的重现性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取虎杖苷对照品(批号：111575-200502，中国食品药品检定研究院)16.29 mg，置50 mL量瓶中，加稀乙醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.2916 mg/mL的虎杖苷对照品溶液Ⅰ。精密吸取虎杖苷对照品溶液Ⅰ15 mL，置25 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1750 mg/mL的虎杖苷对照品溶液Ⅱ。精密量取对照品溶液Ⅰ3 mL，置10 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.08748 mg/mL的虎杖苷对照品溶液Ⅲ。

取已知含量的样品(批号：190303，虎杖苷含量：1.292 mg/g)约0.15 g(共9份，分3组)，精密称定，置25 mL容量瓶中，分别精密加入虎杖苷对照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ1 mL各3份，再分别加入稀乙醇定容至刻度，依照“2.2.2.2”项下方法制成供试品溶液，照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算虎杖苷的回收率。结果：虎杖苷的平均回收率为102.8%，RSD为0.5%(n=9)。见表2。

表2 加样回收试验结果 (n=9)

2.2.9 样品含量测定 取10批样品，依照“2.2.2.2”项下方法制成供试品溶液，照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，按外标法以峰面积计算供试品的含量，共计10批。见表3。

表3 10批样品虎杖苷含量测定结果

3 讨论

3.1 TLC色谱分析 原标准中金钱草薄层鉴别采用冷浸处理耗时较长，检验效率低。经摸索，采用超声处理，再经氧化铝柱洗脱除杂后，斑点清晰且检验效率提高。因此，以样品超声后经氧化铝柱洗脱除杂作为金钱草薄层鉴别供试品制备方法。

原标准中采用大黄素、大黄酚为对照作为虎杖和决明子鉴别项，专属性较差。经查阅文献，虎杖中主要含有二苯乙烯类、蒽醌类及黄酮类等成分，其中二苯乙烯类中的虎杖苷和白藜芦醇是虎杖的主要活性成分[2]，故选择虎杖苷对照品作为虎杖的专属性鉴别项。决明子的主要活性成分为蒽醌类成分，且含量较高。蒽醌类成分有大黄酚、大黄素甲醚、美决明子素、黄决明素、决明素、橙黄决明素、大黄素、芦荟大黄素、意大利鼠李蒽醌-1-O-葡萄糖苷、1-去甲基橙黄决明素、黄决明素、2-O-β-D葡萄糖苷等[3]，且都有明显的药理活性，故选择橙黄决明素对照品作为决明子的专属性鉴别项。

原标准中丹参薄层鉴别以丹参对照药材、原儿茶醛、丹酚酸B作为对照。经查阅文献，丹参化学成分主要包括脂溶性成分和水溶性成分，水溶性成分主要是酚酸类物质，主要包含丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶醛、紫草酸等，其中，丹酚酸A、丹酚酸B是水溶性成分中重要的活性单体[4]。由于丹参对照药材所含成分较多，各斑点分离不完全；原儿茶醛非丹参专属性成分，故取消以丹参对照药材、原儿茶醛为对照的鉴别。此外，样品中丹酚酸B鉴别色带较重，斑点分离度较差，故优化以丹酚酸B为对照的鉴别，选用热水超声提取、乙醚萃取代原标准中采取的甲醇超声提取、过D101大孔吸附树脂柱、再用水饱和乙酸乙酯萃取的繁琐操作，优化后的方法操作简单，色谱斑点清晰且Rf值较好，达到定性鉴别目的。

原标准中柴胡薄层鉴别以柴胡对照药材为对照，对照药材色谱中斑点较多，供试品色谱与对照药材色谱相应位置上仅显一个相同颜色荧光斑点，故对柴胡薄层鉴别进行优化。经查阅文献，柴胡中柴胡皂苷主要有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d等[5]。采用柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d对照品为对照进行研究，结果：供试品中，在与柴胡皂苷b2对照品相应的位置上，斑点清晰，Rf值较好。故选择柴胡皂苷b2对照品作为柴胡的专属性鉴别项。

3.2 HPLC色谱分析

3.2.1 指标成分选择 原标准以大黄素为含量测定指标，考虑大黄素为虎杖和决明子共有成分，专属性不强，该试验旨在增加本品专属性强的含量测定方法。连钱草、金钱草为双君药，连钱草主要含萜类、黄酮和黄酮苷类、有机酸类等[6]，金钱草的主要化学成分是黄酮和酚酸类化合物[7]，这两味药化学成分相似，经对两味药中主要成分芦丁、木犀草素、槲皮素、山柰素进行含量测定探索性研究，所测成分含量均较低，且专属性差，不宜作为本品含量测定的指标性成分。处方中虎杖为臣药，其主要成分虎杖苷在处方中专属性强、含量高，故增加虎杖中虎杖苷作为含量测定指标。

3.2.2 流动相选择 本试验条件参考了《中国药典》2015年版一部[8]“虎杖”项下虎杖苷含量测定，流动相为乙腈-水(23∶77)。结果，虎杖苷色谱峰纯度、重现性较差。根据参考文献，试验考察比较了乙腈-水(18∶82)[9]、乙腈-0.1%磷酸溶液系统梯度洗脱。结果，乙腈-0.1%磷酸溶液条件下峰纯度符合要求，无拖尾现象。故以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，按照表1规定进行梯度洗脱。

3.2.3 前处理方法选择 考察了甲醇、乙醇和稀乙醇对提取效果的影响，结果以稀乙醇为提取溶剂提取的虎杖苷含量最高；超声处理、加热回流、振摇提取效果无明显差异，为了方便操作，故选超声提取方法；超声15、30、45 min，虎杖苷含量基本一致。综合考虑，以稀乙醇超声处理30min作为虎杖苷的提取条件。

3.2.4 HPLC法耐用性考察 本研究考察了色谱柱[ Ultimate XB-C18( 250 mm×4.6 mm)、Ultimate LP-C18( 250 mm×4.6 mm)、Ultimate AQ-C18( 250 mm×4.6 mm)]，柱温(30 ℃、35 ℃、40 ℃)，流动相酸度(乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸)，流速( 0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)，考察发现，不同条件所得检测结果无明显差异，RSD值均在3.0%以下，色谱图所示虎杖苷峰型具备对称性，且尖锐，呈现出良好的分离度，表明此法在不同色谱柱、不同柱温、不同磷酸浓度、不同流速耐用性良好。

综上所述，本研究制定的金钱胆通颗粒质量控制方法准确可靠、专属性强、重现性好，可以作为控制金钱胆通颗粒质量的有效方法。