赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶4C在食管癌中的研究进展

张鑫众，孙倩倩，王锦姝，刘 刚

(1.新乡医学院，河南 新乡 453003；2.河南省人民医院肿瘤内科，河南 郑州 450003；3.河南省人民医院临床单细胞生物医学中心，河南 郑州 450003)

食管癌是最常见的消化道肿瘤之一，其发病率和病死率在世界上分别位于第7位和第6位[1]。由于食管癌的发病隐匿，大多数食管癌患者确诊时已发展到中晚期，因此，治疗失败、复发和转移是食管癌患者病死率高的主要原因之一[2]。食管癌的形成、演变和转移是一个多分子参与、相互调节的复杂生物学过程，其中表观遗传学改变起着重要作用。表观遗传学是指除调控DNA基因序列表达以外的综合因素，不涉及DNA序列的变化，主要包括：组蛋白修饰、基因启动子区CpG岛的甲基化和微RNA(microRNA,miRNA)的甲基化等，其中组蛋白甲基化表观遗传学调控在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[3]。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶4C(lysine-specific histone demethylase 4C，KDM4C)是一种重要的组蛋白去甲基化酶，可以催化去除组蛋白赖氨酸残基甲基化标记，参与调控染色质结构和稳定、基因转录沉默、维持胚胎干细胞自我更新、分化潜能等生物进程[4]。研究显示，KDM4C在食管癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤中呈现高频扩增或过表达，并与肿瘤的进展密切相关[5-8]。本文针对KDM4C在食管癌发生、发展中的作用及其靶向抑制剂的相关研究进行综述，以期为食管癌的早期诊断及靶向治疗药物的研发提供参考。

1 KDM4C的结构和生物学功能

KDM4C又被称为食管鳞状细胞癌扩增基因1(gene am-plified in squamous cell carcinoma 1，GASC1)。2000年，YANG等[4]使用荧光原位杂交和Southern blot分析绘制了9p23-24扩增子，通过Northern blotting筛选该扩增子中存在的靶基因转录本，利用该方法成功从食管癌细胞系中克隆并扩增出新基因GASC1，GASC1在多种恶性肿瘤组织中过表达。KDM4C基因位于9p24.1，长度约为407 kb，全长 3 171个碱基，共有1 056个氨基酸，是由1个N末端十字域(Jumonji N，JMJN)结构域和1个C末端十字域(Jumonji C，JMJC)结构域、2个植物同源结构域(plant homeodomains，PHD)与Tudor结构域组成[9-11]。其中，JMJC结构域作为JMJD家族的酶活性中心存在，构成组蛋白去甲基化功能的催化部分，JMJN结构域主要与KDM4C的转录与调节相关[12]。

KDM4C是一个通过调控遗传信息分布来维持组蛋白去甲基化和染色体稳定性的关键蛋白，其定位于染色体的有丝分裂过程中，与组蛋白H3赖氨酸K9三甲基化(histone H3K9 trimethylation,H3K9me3)的去甲基化过程密切相关。三甲基化或二甲基化的组蛋白H3K9me3/me2中有特异性结合位点，可与异染色质蛋白1(heterochromatin protein 1，HP1)结合后形成稳定的异染色质从而激活机体的正常保卫机制，阻止正常细胞向癌细胞转变，但由于KDM4C具有很强的去甲基化作用，H3K9me3/me2在其作用下转化为H3K9me1，进而破坏HP1的结合位点，使异染色质难以形成与维持，导致基因不稳定，诱发肿瘤的发生、发展[10,13-14]。KDM4C在正常细胞和肿瘤细胞中均有表达，KDM4C基因不仅参与肿瘤细胞的发生、发展、侵袭等过程，在正常组织中也扮演着重要角色。KDM4C在小鼠胚胎发育的不同时期均有不同程度的表达，且在胚胎后期表达量最高，若在此细胞期沉默KDM4C可使胚胎发育停滞，表明KDM4C可以影响胚胎发育和分化[15]。此外，在胚胎干细胞中下调KDM4C基因的表达和增加组蛋白H3K9me3的合成，可以抑制Pou5f1/Sox2/NANOG信号通路，这些信号通路在维持干细胞多能性和自我更新能力方面发挥重要作用，这表明敲除KDM4C会抑制细胞的增殖分化[16]。与正常组织相比，KDM4C在多种肿瘤组织中的表达明显升高，表明KDM4C的异常高表达与肿瘤发生、发展等过程密切相关。

2 KDM4C与食管癌的发生和发展

食管癌的发生和发展是一个复杂连续的多基因、多步骤过程，其中包括临近组织的侵袭、淋巴组织的转移及经血液系统向远处定植等[17-20]。食管癌的发生和发展受组蛋白甲基化表观遗传学调控，组蛋白的甲基化平衡状态由组蛋白赖氨酸甲基转移酶(histone lysine methyltransferases,HKMTs)与组蛋白赖氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylases,HKDMs)来共同协调与维持[21-23]。KDM4C作为HKDMs的一员，在促进食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移中发挥作用[24]。虽然目前的研究结果支持KDM4C为致癌基因，但对于其过度表达究竟是肿瘤发生的原因还是结果目前还存在争议。因为KDM4C在肿瘤细胞中的基因组扩增和多种致癌特性，所以其主要被认为是一个致癌基因，可作为抗肿瘤表观遗传药物的潜在靶点。

KDM4C作为食管癌细胞系KYSE-150细胞的主要扩增靶点，参与食管癌发生、发展中的转录调控，并在食管癌恶性转化过程中发挥重要作用[4]。有研究将KDM4C表达下调的杂合子小鼠与野生型小鼠进行比较，结果显示，KDM4C低表达的杂合子小鼠良、恶性肿瘤的发生及多样性均降低，选择性敲除KDM4C基因后食管癌的细胞活性受到抑制，体内转化实验显示，KDM4C低表达的杂合子小鼠的肿瘤体积显著减小；表明KDM4C基因敲除可降低食管癌细胞在体内的生存和增殖能力[25]。肿瘤起始细胞(tumor initiating cell，TIC)由于其固有的干细胞特性，被认为是肿瘤发生、发展及肿瘤复发的主要驱动力，从食管癌患者来源的肿瘤标本中可分离出具有乙醛脱氢酶高活性亚细胞群(aldehyde dehydrogenase bright stem cells，ALDHbri+)亚型细胞群，同样具有干细胞特性[26]。YUAN等[27]研究显示，通过下调KDM4C降低食管癌中ALDHbri+TIC的表达，可使食管癌的恶性进展受到显著抑制。KDM4C在食管癌中的表达与淋巴结转移和肿瘤分期等密切相关，在已经发生转移的食管癌患者中，KDM4C阳性率远高于未发生转移的食管癌患者，靶向敲除KDM4C基因可以降低食管癌的侵袭和转移，因此，通过调控KDM4C的表达可以改善食管癌的病情进展[22,28]。LIU等[5]为验证KDM4C扩增与肿瘤细胞恶性表型之间的关系，对乳腺癌良、恶性细胞系进行了全基因组分析，结果表明，KDM4C扩增表达的细胞系均为侵袭、转移性强的细胞株。

以上研究结果证实，KDM4C伴随着食管癌病情进展而呈现明显的高表达趋势，KDM4C的表达与食管癌的发生、发展、侵袭密切相关。此外，肿瘤组织侵袭转移很大程度上影响癌症患者的治疗与预后，诸多研究表明，超过90%的癌症患者死于远处转移，而并非是肿瘤原发灶[29-30]。

3 KDM4C与食管癌患者的预后

食管癌的早期症状隐匿，其主要表现为吞咽不适，包括吞咽食物时的梗噎感、胸骨后方烧灼感、停滞感或异物感等，常可通过吞咽口水缓解或消失，且症状时轻时重，不易察觉，确诊时多因已进入中晚期而错过最佳的治疗时间[31-34]。虽然食管癌的诊断及治疗已取得重大进展，但多数食管癌患者预后仍较差，主要归因于肿瘤分化程度低、恶性程度高、在确诊时多数已发生侵袭转移。因此，阻止食管癌发生邻近组织的侵袭和远处器官的转移对食管癌的治疗和延长患者生存至关重要[35-37]。

自从KDM4C被从食管癌细胞株中扩增出来，其阳性表达就与肿瘤的发展进程及患者的预后表现出密切的联系[27]。Kaplan-Meier生存分析显示，细胞核中KDM4C高表达的食管癌患者5 a生存率为26.5%，而KDM4C阴性或低表达患者的 5 a生存率为43.7%。多变量分析显示，KDM4C的高表达可作为食管癌患者预后的预测因素[38]。SUN等[16]研究表明，KDM4C在食管癌细胞中可通过调控MDM2启动子上的组蛋白甲基化来诱导其转录，进而降低抑癌基因p53蛋白的表达，促进肿瘤的进展。除了MDM2以外，KDM4C在食管癌细胞中也激活另外2个高危基因PPARG和NANOG，而MDM2、PPARG和NANOG是食管癌预后不良强有力的预测因子[27]。此外，人食管癌细胞中TIC群体的存在被认为是肿瘤患者对化学治疗耐药及复发的主要驱动力。从食管癌患者来源的肿瘤标本中分离的细胞亚群带有ALDHbri+TIC表型，KDM4C可增强食管癌中ALDHbri+TIC亚群的表达，提示KDM4C能够靶向ALDHbri+TIC，影响患者的生存率及预后[27]。因此，针对KDM4C靶向治疗的研究对抑制癌细胞的转移、侵袭和延长食管癌患者的生存时间至关重要[39-40]。

4 KDM4C靶向抑制剂的研究

研究表明，增强KDM4C的催化活性和表达可促进肿瘤进展，通过调控KDM4C的表达可改善食管癌的病情[41-43]。KDM4C对组蛋白甲基化状态的影响与患者的不良预后、复发和耐药性均有关，因此，KDM4C可以作为癌症的潜在治疗靶点[44]。KDM4C抑制剂根据作用机制的不同可分为4类：(1)α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)或2-氧代戊二酸(2-oxoglutarate，2-OG)辅助因子类似物；(2)金属辅助因子干扰剂，该类抑制剂可通过破坏铁和锌辅助因子的结合来抑制KDM4蛋白的催化活性；(3)组蛋白底物竞争性抑制剂，比如赖氨酸组蛋白底物模拟物可竞争性抑制组蛋白去甲基化酶活性；(4)环肽，环肽是最近开发出的一种新型抑制剂，可通过底物和非辅助因子相互作用而选择性抑制KDM4C[45]。然而，迄今为止，KDM4C的有效靶点抑制剂的开发与发展进程仍然较慢。

大多数KDM4C抑制剂是属于α-KG或2-OG辅助因子类似物抑制剂，如草酸衍生物N-草酰甘氨酸(N-Oxalylglycine，NOG)，已被确定为KDM4C的弱抑制剂[46]。这些抑制剂在催化位点竞争性地与KDM4C中的Fe(II)分子结合并抑制该蛋白的关键区域[47]。所有含JMJC的去甲基化酶的去甲基化都需要α-KG，因此，开发KDM4C靶向抑制剂α-KG/2-OG类似物是一种可行的策略。虽然有些2-OG类似物已被证明是有效的抑制剂，但由于这些化合物含有较大的亲水结构，导致其细胞渗透性较差。异羟肟酸酯类的2-OG辅助因子类似物抑制剂NCDM32针对KDM4C的抑制活性是NOG的500倍。化合物SAHA针对KDM4C的抑制活性是NOG的500倍，其针对KDM4C的靶向选择性是NOG的100倍[48]。虽然对异羟肟酸酯类KDM4C选择性抑制剂进行了许多研究，但对其在临床上的选择性和功效的应用研究却少有报道。通过Chem-seq和表型筛选方法鉴定出8-羟基喹啉类衍生物SD70为KDM4C特异性抑制剂[49]。此外，一些吡啶羧酸类化合物也属于KDM4C选择性抑制剂[50]。非铁金属破坏铁和锌辅助因子的结合，如镍通过占据Fe(II)分子结合位点从而抑制KDM4C的催化活性。组蛋白底物竞争性抑制剂CP2显示出对KDM4C的选择性抑制作用(半抑制浓度为39 nmol·L-1)[51]。

KDM4C蛋白在活性位点上具有高度保守性。大多数KDM4C靶向抑制剂结合位点在辅助因子或底物上，易出现较低选择性和脱靶效应[52]。为了克服这一困难，目前探索开发了新的抑制剂类型“环肽”，其通过底物和独立辅助因子的相互作用来靶向抑制KDM4C。环肽结合在KDM4C表面远离活性位点的变构位点和保守程度较低的区域[53]。这些研究结果可能有助于开发KDM4C选择性抑制剂的新结合位点。

5 前景与展望

食管癌细胞的增殖、侵袭和转移严重影响患者的5 a生存率，通过一种特定标志物或基因来有效预测及控制食管癌的病情进展极为重要。对KDM4C的研究有助于了解KDM4C蛋白与其特定基因程序之间的相互作用与机制，从而为食管癌诊断与治疗提供更有力的理论支撑。KDM4C蛋白的表达升高，在多种肿瘤组织和细胞中可促进肿瘤细胞的增殖、转移和血管生成，提示KDM4C可能成为肿瘤治疗的重要靶标[54]。组蛋白甲基化表观遗传学变化具有可逆性，因此将KDM4C靶向抑制剂用于抗癌药物的方案是可行的。目前多数关于KDM4C抑制剂的研究是以辅助因子和底物模拟物为基础，且大多数抑制剂对KDM4C相似的非靶蛋白也有活性，因此，这种抑制剂可以被定义为是非选择性的。开发有效且具有高选择性的KDM4C抑制剂是目前面临的主要任务之一。相比之下，环肽类抑制剂表现出对KDM4C更好的选择性，是最有可能开发为肿瘤靶向治疗的抑制剂类型。