二甲双胍对人急性髓系白血病KG1a细胞增殖和凋亡的影响及其机制

崔珊珊,李雅慧，赵晨瑾，张 震，姬曼曼，王桐桐，司晓慧，牛新清

(新乡医学院医学检验学院，河南 新乡 453003)

二甲双胍作为单磷酸腺苷激活的蛋白质激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)的激活剂，近年来已从治疗2型糖尿病的一线药物逐渐发展为抗癌药物。二甲双胍通过调控多种信号通路抑制肿瘤细胞的生长，对食管癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤细胞的生长均有抑制作用[1]。ARRIETA等[2]研究发现，二甲双胍联合酪氨酸激酶抑制剂可显著延长携带表皮生长因子受体突变的晚期肺癌患者的无进展生存期和总生存期，且不良反应与单独使用靶向药物一致。但目前二甲双胍对急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)作用的相关研究报道较少。急性髓系白血病KG1a细胞系在形态上处于细胞发育的早期阶段，是具有白血病干细胞特性的早期髓系白血病细胞，对常规化学治疗药物耐药[3-4]。因此，本研究选取KG1a细胞为研究对象，探讨二甲双胍对其增殖、凋亡的影响及作用机制，以期为二甲双胍用于临床难治性白血病的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器AML细胞株KG1a由南方医科大学珠江医院提供，本实验室冻存。胎牛血清和RPMI1640 培养液购自美国Gibco 公司，100×链霉素/青霉素溶液购自美国Hyclone公司，二甲双胍购自上海生工生物工程技术服务有限公司，细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)购自日本Dojindo公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexinV-fluorescin isothiocyanate，AnnexinV-FITC)/碘化丙锭(propidium iodide,PI)细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，放射免疫沉淀实验细胞裂解液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer,RIPA)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒及羊抗兔二抗购自中国康为世纪生物科技有限公司，β-肌动蛋白(β-actin)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase α,AMPKα)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase，P70S6K)、4E-结合蛋白-1(eIF4E-binding proteins-1,4EBP-1)、Thr172位点磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶[phosphorylated AMP-activated protein kinase at Thr172 site,pAMPK(Thr172)]、磷酸化蛋白激酶B[phosphorylated protein kinase B at Ser473 site,pAKT(Ser473)]、Thr37/46位点磷酸化核糖体蛋白S6激酶[phosphorylated ribosomal protein s6 kinase at Thr37/46 sites，pP70S6K(Thr37/46)]、Thr389位点磷酸化4E-结合蛋白-1[phosphorylated eIF4E-binding proteins-1 at Thr389 sites,p4EBP-1(Thr389)]兔抗人一抗购买自美国CST公司。Thermo 酶标仪购自上海赛默生物科技发展有限公司，BD 流式细胞仪购自美国 BD 公司，Mini Trans-Blot 电泳仪购自美国Bio-Rad 公司，Thermo Scientific CO2恒温培养箱购自郑州金宁仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养取AML细胞株KG1a，接种于含体积分数 10% 胎牛血清、1 × 106U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、含体积分数 5% CO2、相对湿度95%的恒温培养箱中传代培养，每1～2 d更换1次培养液，3～4 d传代1次，使用倒置显微镜观察细胞生长情况，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 CCK-8测定法检测细胞增殖能力取处于对数生长期KG1a细胞，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞悬液至终细胞浓度为8×107L-1，以每孔100 μL细胞悬液接种到96孔板中，随机分为对照组及2、4、6、8、10、12、16、24、32 mmol·L-1二甲双胍组，分别加入终浓度0、2、4、6、8、10、12、16、24、32 mmol·L-1二甲双胍，另设一不含细胞与药物的空白组作为比对，每个浓度设3个复孔。将96孔板置于37 ℃、含体积分数 5% CO2恒温培养箱中培养48 h，然后分别加入10 μL CCK-8，置于37 ℃、含体积分数5% CO2恒温培养箱中培养1.5 h，使用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度值，设3个复孔，取平均值。计算细胞存活率，细胞存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡情况取对数生长期KG1a细胞，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞悬液至终浓度为1×109L-1，以每孔2.0 mL接种到6孔板上，随机分为对照组及2、6 mmol·L-1二甲双胍组，分别加入终浓度0、2、6 mmol·L-1二甲双胍，将6孔板置于37 ℃、含体积分数 5% CO2恒温培养箱中常规培养48 h，收集细胞，将细胞悬于300 μL 细胞结合缓冲液中，加入5.0 μL Annexin V-FITC轻轻混匀，室温避光孵育15 min后，加入5.0 μL PI，12 000 r·min-1离心 5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞。然后，加入10 μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，流式细胞仪检测细胞凋亡，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。使用Flowjo软件进行数据分析。

1.2.4 免疫印迹法检测AMPK通路蛋白表达水平取对数生长期KG1a细胞，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞悬液至终浓度为1×109L-1，以每孔2.0 mL接种到6孔板上，随机分为对照组及2、6 mmol·L-1二甲双胍组，分别加入终浓度0、2、6 mmol·L-1二甲双胍，将6孔板置于 37 ℃、含体积分数5% CO2恒温培养箱中常规培养48 h;药物作用完成后磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗细胞2次，每组加入300 μL RIPA，冰上裂解30 min。将EP管放入离心机，12 000 r·min-1离心 15 min，离心后吸取上清用BCA进行蛋白浓度测定。根据蛋白浓度计算上样体积，蛋白中加入上样缓冲液，95 ℃煮蛋白10 min使其变性后进行丙烯酰胺垂直电泳，将胶上蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上，转膜结束置于50 g·L-1脱脂奶粉中封闭1.5 h，加入兔抗人β-actin、AMPKα、AKT、P70S6K、4EBP1、Thr172p-AMPKα、Ser473p-AKT、Thr37/46p-P70S6K、Thr 389p-4EBP1一抗(稀释比例均为11 000)，4 ℃低温孵育过夜，第2天用含Tween-20 的 PBS 洗膜3次，每次5 min;加入羊抗兔二抗(稀释比例为15 000)，室温孵育1 h，应用含 Tween-20 的 PBS洗膜 3 次，每次5 min;发光显色、拍照，应用 Image J 软件分析条带灰度值。以目的条带的灰度值与内参蛋白条带的灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1 10组KG1a细胞存活率比较对照组及2、4、6、8、10、12、16、24、32 mmol·L-1二甲双胍组KG1a细胞存活率分别为(100.02±0.03)%、(73.23±4.47)%、(57.08±3.04)%、(50.51±1.09)%、(44.72±0.81)%、(39.29±0.63)%、(38.41±1.92)%、(30.33±1.48)%、(25.01±0.87)%、(22.65±1.19)%。与对照组比较，各浓度二甲双胍处理组KG1a细胞存活率显著减低，且呈浓度依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)。二甲双胍对KG1a细胞的半数抑制浓度为6 mmol·L-1，以6 mmol·L-1为后续实验工作浓度选择的参考。

2.2 3组KG1a细胞凋亡率比较结果见图1。对照组、2 mmol·L-1二甲双胍组及6 mmol·L-1二甲双胍组KG1a细胞凋亡率分别为(6.64±0.63)%、(19.14±1.21)%、(26.87±1.09)%。2 mmol·L-1二甲双胍组和6 mmol·L-1二甲双胍组KG1a细胞凋亡率高于对照组，6 mmol·L-1二甲双胍组KG1a细胞的凋亡率高于2 mmol·L-1二甲双胍组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

A：对照组；B：2 mmol·L-1二甲双胍组；C：6 mmol·L-1二甲双胍组

2.3 3组KG1a细胞AMPK信号通路蛋白比较结果见表1和图2。2 mmol·L-1二甲双胍组和6 mmol·L-1二甲双胍组KG1a细胞中AKT、AMPKα、P70S6K、4EBP-1及p-P70S6K(Thr37/46)、p-4EBP1(Thr389)蛋白相对表达量显著低于对照组，p-AMPKα(Thr172)、p-AKT(Ser473)蛋白相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。6 mmol·L-1二甲双胍组KG1a细胞中AKT、AMPKα、P70S6K、4EBP-1及p-P70S6K(Thr37/46)、p-4EBP-1(Thr389)蛋白相对表达量显著低于2 mmol·L-1二甲双胍组，p-AMPKα(Thr172)、p-AKT(Ser473)蛋白相对表达量显著高于2 mmol·L-1二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组KG1a细胞AMPK通路蛋白相对表达量比较

1:对照组；2：2 mmol·L-1二甲双胍组；3：6 mmol·L-1二甲双胍组。

3 讨论

AML是一种造血干细胞恶性克隆性疾病，主要采用联合化学治疗和造血干细胞移植治疗。目前尽管AML缓解率很高，但仍有相当比例的AML患者复发[5]。AML复发主要原因是体内残存少量的白血病干细胞。近年来，二甲双胍已从治疗2型糖尿病的一线药物逐渐发展成抗癌药。研究发现，二甲双胍可通过抑制肿瘤干细胞的生长起到抗癌作用，其相关机制和影响因素已成为近年来的研究热点[6]。PATIL等[7]研究发现，二甲双胍能抑制原代口腔癌细胞干细胞相关基因的表达。CUYS等[8]研究发现，二甲双胍能通过抑制核因子κB受体活化因子配体过表达增加乳腺癌干细胞系对地诺单抗的敏感性。KIM等[9]研究发现，二甲双胍对部分结直肠癌干细胞的生长有抑制作用，且结直肠癌干细胞对二甲双胍的敏感性可能与细胞谷氨酰胺的代谢水平有关，耐药细胞的谷氨酰胺酶和谷氨酰胺转运体的水平高于敏感细胞，谷氨酰胺酶抑制剂与二甲双胍联合应用可增加结直肠癌干细胞敏感株与耐药株对二甲双胍的敏感性。但目前国内针对二甲双胍对AML的治疗作用尚未见相关研究报道。本研究结果显示，不同浓度二甲双胍干预KG1a细胞后其存活率显著降低，且随二甲双胍浓度的升高KG1a细胞存活率呈显著下降趋势，与PATIL等[7]和CUYS等[8]研究结果一致，进一步证实二甲双胍可以诱导致KG1a细胞凋亡，且呈浓度依赖性，提示二甲双胍可应用于临床AML的治疗。

AMPK是一种保守的蛋白激酶，能够监测到细胞能量状态，并在能量受限条件下保护细胞功能。AMPK被称为代谢肿瘤抑制剂，可抑制细胞增殖，在被激活后，其合成代谢通路被抑制，分解代谢通路被激活，活化的AMPK可抑制糖异生及脂肪和蛋白质的合成，同时刺激肝脏中的脂肪酸氧化和葡萄糖摄取。AMPK下游靶蛋白P7OS6K和真核细胞启动子4EBP1与致癌蛋白的合成有关[10]。二甲双胍作为AMPK的激活剂，可抑制线粒体复合体Ⅰ抑制细胞的氧化磷酸化[11-12]。而细胞能量供应减少可导致单磷酸腺苷/三磷腺苷(adenosine monophosphate/adenosine triphosphate，AMP/ATP)比例升高，从而激活AMPK。AMPK激活可以直接或间接抑制其下游的哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白，导致其下游靶蛋白P70S6K和4EBP1的磷酸化水平降低，使细胞内蛋白质的合成下降，进而抑制肿瘤细胞生长[13-14]。本研究结果显示，随着二甲双胍浓度的增高，KG1a细胞AMPKα、P70S6K、4EBP1 p-P70S6K、p-4EBP1相对表达量明显下降，表明二甲双胍可抑制KG1a细胞P70S6K、4EBP1的合成及其磷酸化，通过激活AMPK通路抑制KG1a细胞的增殖。

AKT可调控多个生物过程，包括细胞存活、凋亡和糖原代谢。AKT通过下游多种途径对靶蛋白进行磷酸化而发挥抗凋亡作用，如ATK激活IkB激酶，导致核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抑制剂 IκB的降解，从而使NF-κB从细胞质中释放出来进行核转位,激活其靶基因而促进细胞的存活；AKT可磷酸化Bcl-2家族成员BAD，使其与14-3-3结合，从而阻止其与Bcl-XL结合而诱导细胞凋亡；此外，AKT能抑制蛋白水解酶caspase-9的活性而阻止凋亡级联反应的激活。肿瘤抑制因子p53为转录因子，能够调控细胞凋亡、DNA修复和细胞周期的停滞；AKT能通过磷酸化p53结合蛋白MDM2影响p53的活性，磷酸化的MDM2转位到细胞核与p53结合，通过增加p53蛋白的降解而影响细胞存活。叉头状转录因子FOXO1调节涉及多种细胞功能基因的表达，包括凋亡、DNA修复、细胞周期的停滞和葡萄糖代谢等，AKT磷酸化FOXO1，抑制其核转位而阻止其转录激活作用。本研究结果显示，随着二甲双胍浓度的增高，AKT相对表达量呈显著降低，p-AKT及p-AMPKα相对表达量显著增高，与WANG等[15]研究结果一致，提示二甲双胍可能通过抑制AKT的表达、增加AKT及AMPKα的磷酸化诱导了KG1a细胞凋亡。

综上所述，二甲双胍可抑制具有白血病干细胞特性的KG1a细胞增殖，促进其凋亡，其机制可能与二甲双胍调控AMPK信号通路有关。