不同强度运动对高脂饮食大鼠窦房结及心功能的保护作用

刘福泉，郝丽娇，王 维，柳 净，刘 尊，董珊珊

(1.沧州医学高等专科学校健康管理与服务系，河北 沧州 061001；2.沧州市妇幼保健院手术室，河北 沧州 061001)

窦房结是心脏正常的起搏位点，对心功能起着重要的调节作用[1]。研究发现，长期高脂饮食可造成脂肪过度向心内浸润，当脂肪浸润到窦房结会使其结构功能发生变化，神经受损，动脉狭窄，影响心脏功能，严重时可致死亡[2]。有研究报道，通过长期有规律的有氧运动能够降低体内脂肪含量[3]，但有关运动能否抑制脂肪向心脏浸润鲜有报道。基于此，本研究从窦房结组织形态变化、脂肪浸润量及窦房结神经变化，探讨不同强度运动对长期高脂饮食引发的不良心脏功能的保护作用，旨在为健身锻炼提供科学的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，体质量(191.23±9.84)g，由广州中医药大学实验动物中心提供。大鼠于无特定病原级动物实验室饲养，饮用双蒸水，室温为(23±2)℃，空气湿度为40%～70%，分笼饲养，每笼 3只，共8笼。

1.2 试剂与仪器蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP 9.5)抗体购自北京博奥森生物科技有限公司，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染液、油红O染液购自南京建成生物工程研究所；Vevo2100型小动物彩色多普勒超声诊断仪购自加拿大VisualSonics公司，石蜡包埋机、冰台、石蜡切片机、摊片机、全自动组织脱水机购自德国莱卡公司，光学显微镜、彩色数码CCD摄像头购自德国麦克奥迪公司，电子天平购自上海天平仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组与处理将大鼠适应性饲养(国家标准颗粒型固体大鼠饲料)1周后，随机分为A、B、C、D组，每组6只。A组大鼠给予普通饲料饲养；B组、C组和D组大鼠给予高脂饲料喂养，高脂饲料依据文献报道[4]配制(质量分数):普通饲料 54.5%、蔗糖20.0%、蛋黄粉15.0%、猪油9.0%、胆固醇1.0%、胆酸钠0.5%。C组大鼠给予高脂饲料喂养同时给予运动训练，运动方法采用游泳训练法[5-6]：水深为大鼠身体长度的2倍，水温控制在(33±2)℃，每次放入水中3只大鼠，保证每只大鼠至少占有 0.05 m2的水面。实验过程中为保持运动强度以小棍驱赶大鼠运动，每天确保在同一时间进行训练。正式训练前，第1周进行适应性游泳，每天逐渐增加游泳时间，第1周末游泳时间达到1 h；第2周开始正式实验，每日60 min，每周6 d，持续训练8周。D组大鼠给予高脂饲料喂养同时给予运动训练，第1周适应性游泳训练后，逐渐增加负重进行5%体质量负重游泳，其余运动训练方法同C组，每日60 min，每周6 d，持续训练8周。

1.3.2 大鼠心功能测试干预8周后，清除各组大鼠胸部毛发，使用体积分数2%异氟烷吸入麻醉，应用Vevo2100型小动物彩色多普勒超声诊断仪测量大鼠左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter，LVDS)、左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVDD)、左心室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume，LVVS)、每搏输出量(stroke volume，SV)、左心室射血分数(left ventricular ejection fractions，LVEF)、左心室缩短分数(left ventricular shortening fraction，LVSF)。

1.3.3 大鼠窦房结取材及形态结构观察末次游泳24 h后，各组大鼠用体积分数10%水合氯醛(0.04 mL·g-1)麻醉，取心脏，右心耳侧朝上固定，以界沟为中心左右各5 mm平行剪开，上下腔静脉处平行剪开，得一条形组织即为窦房结。取窦房结用体积分数95%的乙醇固定15 min，自来水冲洗1 min，苏木精染色15 min，自来水冲洗1 min，伊红染色35 s，自来水冲洗1 min，二甲苯透明5 min，中性树胶封片，显微镜观察其形态结构。

1.3.4 油红O染色法检测大鼠窦房结脂肪细胞分布及含量采用油红O染色法测量窦房结区脂肪细胞分布[7-8]：取窦房结组织，冰冻切片机切取15 μm 厚组织并贴于载玻片上，待组织恢复室温，蒸馏水冲洗2 s，体积分数60%异丙醇浸洗2 s，油红O染液浸染10 min，体积分数60%异丙醇浸染分色2 s；蒸馏水洗涤1 s，苏木精复染2 min，自来水水洗10 min，蒸馏水冲洗 1 s，滤纸吸干水分，甘油封片，光镜下观察窦房结脂肪细胞分布，红色为脂肪细胞，应用Image-Pro Plus软件进行窦房结脂肪细胞染色阳性面积定量分析，计算整个视野内选定对象的面积总和[9-10]。

1.3.5 免疫组织化学法检测大鼠窦房结神经标志物PGP 9.5表达应用ABC法进行免疫组织化学染色：取窦房结组织，使用全自动脱水机脱水、浸蜡、包埋，采用Leica石蜡切片机对组织蜡块进行厚度为 5 μm 连续切片，每隔10张选1张，连续取4张，置于60 ℃ 恒温干燥箱烘片1 h，乙醇脱蜡水化后将组织放入含有修复液的高压锅中加热，有蒸汽冒出时开始计时3 min，修复完成后，自然冷却至37 ℃左右，磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)反复清洗，滴加山羊血清，静置20 min，滴加PGP 9.5 一抗，4 ℃过夜，PBS清洗，滴加二抗(SAB),PBS清洗，滴加DAB显色剂，显微镜观察，判断显色程度，自来水冲洗，苏木精染色，温水反蓝，二甲苯透明，显微镜观察，应用Image-Pro Plus软件进行PGP 9.5染色阳性面积定量分析，计算整个视野内选定对象的面积总和[9-10]。

2 结果

2.1 4组大鼠心脏功能比较结果见表1。4组大鼠LVDS、LVDD、LVVS、SV、LVEF、LVSF比较差异有统计学意义(F=6.840、6.698、4.884、15.333、17.293、41.025，P<0.05)。B组大鼠LVDS、LVDD、LVVS显著高于A组，SV、LVEF、LVSF显著低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。C组大鼠LVDS、LVDD、LVVS、SV、LVEF与A组比较差异无统计学意义(P>0.05);C组大鼠LVSF显著高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。C组大鼠LVDS、LVDD、LVVS显著低于B组，SV、LVEF、LVSF显著高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。D组大鼠SV显著低于A组，LVSF显著高于A组，LVEF、LVSF显著高于B组，SV显著低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；D组大鼠其余心功能指标分别与A组、B组及C组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 4组大鼠心功能指标比较

2.2 4组大鼠窦房结组织结构变化结果见图1。A组大鼠窦房结形态结构完整，细胞质丰富染色均匀，细胞间隙正常。B组大鼠窦房结结构缺失，细胞间隙明显增宽、肌纤维排列混乱。C组大鼠窦房结形态结构良好，细胞间隙均匀较窄，细胞质染色均匀。与C组相比，D组大鼠窦房结形态结构欠佳，细胞间隙略增宽。

图1 4组大鼠窦房结组织结构(HE染色，×40)

2.3 4组大鼠窦房结区脂肪细胞分布及其含量比较结果见图2。油红O染色结果显示，窦房结区脂肪细胞呈橘红色，细胞核呈蓝色。与A组相比，B组、C组、D组大鼠窦房结区均出现大面积脂肪浸润，B组脂肪浸润最为严重，D组次之，C组较轻。A组、B组、C组、D组大鼠窦房结区脂肪细胞表达量分别为(675.5±53.16)、(3 263.00±560.53)、(1 007.75±230.88)、(2 227.12±632.43)mm2。4组大鼠窦房结区脂肪细胞阳性表达量比较差异有统计学意义(F=29.657，P<0.05)。B组、C组、D组大鼠窦房结区脂肪细胞阳性表达量显著高于A组，B组大鼠窦房结区脂肪细胞阳性表达量显著高于C组和D组，D组大鼠窦房结区脂肪细胞阳性表达量显著高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 4组大鼠窦房结区脂肪细胞染色结果(油红O染色，×10)

2.4 4组大鼠窦房结区PGP9.5阳性表达及表达量的比较结果见图3。PGP9.5免疫反应阳性细胞胞质呈棕灰色，神经组织多呈团块状。A组大鼠神经细胞最多且棕色较重，呈聚集状；其次依次为C组、D组、B组，且棕色逐渐变淡。A组、B组、C组、D组大鼠窦房结区PGP9.5阳性表达量分别为(3 348.1±429.19)、(698.9±62.24)、(3 198.5±264.17)、(1 895.2±97.28)mm2。4组大鼠窦房结区PGP9.5阳性表达量比较差异有统计学意义(F=32.476，P<0.05)。A组大鼠窦房结区PGP9.5阳性表达量显著高于B组和D组，C组和D组大鼠窦房结区PGP9.5阳性表达量显著高于B组，C组大鼠窦房结区PGP9.5阳性表达量显著高于D组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 4组大鼠窦房结组织PGP9.5表达(免疫组织化学，×10)

3 讨论

脂肪组织是人体最大的旁分泌与内分泌器官，能够分泌多种具有生物活性的脂肪细胞因子，其分泌的抵抗素、瘦素、内脂素、脂联素等脂肪细胞因子可够促进心肌细胞纤维化，严重影响心脏功能[11-13]。而心外膜脂肪组织是最靠近心脏的脂肪组织，包裹心脏表面的80%[14-15]，随着年龄的增长，心外膜脂肪组织会逐渐向心脏内部浸润，一旦波及窦房结，将严重影响窦房结起搏及传导功能。长期高脂饮食可造成脂肪过度向心内浸润，影响心脏功能。本研究结果显示，B组大鼠心脏功能指标中LVDS、LVDD、LVVS显著高于A组，SV、LVEF、LVSF显著低于A组，与王全河等[16]和王维敏[17]研究结果相同，证实长期高脂饮食可导致心功能显著下降。本研究结果显示，与A组比较，B组大鼠窦房结结构缺失，细胞间隙明显增宽、肌纤维排列混乱；窦房结区出现大面积脂肪浸润，脂肪细胞阳性表达量显著增高，窦房结区PGP9.5阳性表达量显著降低，说明长期高脂饮食加速了脂肪组织向心内浸润，导致窦房结结构缺失，细胞间隙明显增宽、肌纤维排列混乱，内部出现严重的脂肪浸润，致使窦房结结构功能发生变化、神经受损、动脉狭窄等，从而影响心脏功能。

长期系统有规律的运动能够改变心脏形态结构，并使其功能发生一系列的适应性变化，从而进一步增强心脏泵血功能。本研究结果显示，与B组相比，C组、D组大鼠LVDS、LVDD、LVVS显著低于H组，SV、EF显著高于B组；D组大鼠仅LVSF显著高于B组；D组大鼠心脏功能指标LVDS、LVDD、LVVS略高于C组，EF、LVSF略低于C组，但差异无统计学意义；D组大鼠SV显著低于C组。这一结果说明，通过有规律的运动能够抑制高脂饮食造成的心功能下降现象，且有氧运动对心功能改善的效果要好于高强度运动。运动可增加能量消耗，降低体内脂肪含量。马伏英等[18]研究认为，有氧运动能够调节脂肪代谢，减少脂肪堆积；BAE等[19]和刘子铭等[20]研究发现，有氧运动能够降低体内脂肪含量；MATSUNAGE等[21]和CHIU等[22]研究发现，高强度运动能够降低体内脂肪含量。本研究结果显示，与B组相比，C组、D组大鼠脂肪浸润现象显著减轻，窦房结脂肪含量显著降低；与C组相比，D组大鼠窦房结区脂肪含量显著降低，D组大鼠窦房结形态结构欠佳，细胞间隙略增宽；这证实长期有规律的有氧运动能加速体内脂肪消耗，减轻体内脂肪过多堆积，阻止脂肪向窦房结的浸润，且其效果好于高强度运动。

窦房结神经细胞数量直接影响窦房结搏动及传导功能，进而影响心脏功能。有关运动对神经影响的研究已证实，有氧运动可以通过促使心内神经体积变大且数量增加来抵抗由于年龄增加导致的神经退行性变化[23]，有规律的运动能够通过调节神经细胞因子的分泌及表达，调节神经递质表达[24]；但长时间大强度运动可导致神经胶质细胞肿胀，且神经元细胞周围空泡增多[25]。PGP9.5是神经标志物，其特异性染色为神经系统研究提供了高质量的技术，可特异性标志神经纤维及神经细胞，因此，本研究采用PGP9.5免疫组织化学来标记窦房结内部神经的变化，分析高脂饮食及运动对窦房结神经的影响。本研究结果显示，C组和D组大鼠窦房结PGP9.5阳性表达量显著高于B组，空泡程度减轻，说明有规律的运动消耗了体内脂肪，同时增加了细胞的抗氧化性，使窦房结神经损害得到改善；C组大鼠窦房结PGP9.5阳性表达量显著高于D组，说明长期有规律的有氧运动更能有效抑制脂肪浸润造成的窦房结神经纤维化、促使窦房结神经重塑。

综上所述，长期有规律的有氧运动能够显著减轻高脂饮食引起的窦房结脂肪浸润，促使窦房结神经重塑，维持正常窦房结组织结构及心脏功能。