不同来源威灵仙抗炎镇痛谱效关系研究

2021-11-18鞠成国唐婷婷

现代中药研究与实践 2021年5期

鞠成国，张强，唐婷婷，王巍*

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600； 2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁大连 116600）

威灵仙始载于《新修本草》，味辛、咸，性温，其性猛善走，通行十二经脉，具有很好的祛风湿、通经止痹痛的功效[1]，现代药理学研究表明威灵仙在抗炎镇痛方面有很好的疗效[2-3]。2020 年版《中国药典》（一部）规定威灵仙为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensisOsbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetalaPall.或东北铁线莲Clematis manshuricaRupr.的干燥根和根茎[4]。现代化学成分研究表明威灵仙含有大量的皂苷类成分[5]，因基原不同，其化学成分间亦存在一定差别。由于成分决定疗效，因此不同基原威灵仙的抗炎镇痛效果势必有所不同。本研究旨在对不同基原威灵仙进行药效学及化学成分进行比较，并构建药效与化学成分的谱效关系，为威灵仙抗炎镇痛的物质基础研究提供支持，并为威灵仙饮片的炮制加工及临床合理用药提供理论研究基础。

1 材料与方法

1.1 试药

S0-1 为威灵仙对照药材、S0-2 为棉团铁线莲对照药材（均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为121189-201102、121578-201202）；S1-S11 批威灵仙药材经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定，均为正品，信息见表 1；阿司匹林肠溶片（北京曙光药业有限责任公司，批号：20140607）。

表 1 样品信息Tab. 1 Information of samples

1.2 动物

SPF 级昆明小鼠，雄性［购自辽宁长生生物技术有限公司，动物许可证号为：SCXK（辽）2020-0001］，体质量为（20±2）g。

1.3 试剂

二甲苯、冰醋酸为化学级，均购自成都市科龙化工试剂厂；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，均购自天津科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.4 仪器

Agilent 1100 型高效液相色谱系统（美国安捷伦科技公司）；FA1004B 型分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 威灵仙给药溶液及阳性药溶液制备分别称取各批次药材适量，加8 倍量、6 倍量水，水煎提取两次，每次1 h，合并滤液，滤液蒸干研细备用。取适量干粉，加水混溶，制成浓度为0.13 g/mL 的威灵仙混悬液；取阿司匹林肠溶片，用研钵研磨成细粉状，称取粉末适量，加水制成0.01 g/mL 的阿司匹林混悬液[6]。

1.5.2 耳肿胀抗炎实验小鼠适应性饲养1 周后，随机分成14 组，每组10 只。即空白组、模型组、阿司匹林组、威灵仙S1-S11 组。各批次威灵仙及阿司匹林组灌胃相应给药液0.4 mL/20 g，空白组和模型组灌胃等量的水，各组均连续灌胃给药7 d。除空白组外，其余各组小鼠末次给药1 h 后，于右耳前后两面涂抹20 µL 二甲苯致炎。1 h 后脱颈椎处死小鼠，用直径8 mm 的打孔器沿耳缘冲下耳廓，左右两耳取同一部位，分别置于分析天平上称其质量，计算鼠耳肿胀度及抑制率[7]。小鼠耳肿胀度（%） =（小鼠致炎耳片质量－小鼠未致炎耳片质量）/小鼠未致炎耳片质量×100%；肿胀抑制率（%）=（模型组小鼠致炎后耳片平均肿胀度-给药组小鼠致炎后耳片平均肿胀度）/模型组小鼠致炎后耳片平均肿胀度×100%。

1.5.3 冰醋酸扭体镇痛实验小鼠分组及给药方法同“1.5.2”项。末次给药1 h 后，除空白组外各组小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.2 mL。记录给药后15 min 内各小鼠扭体（腹部凹陷、伸展后肢、臀部抬高）次数，计算扭体抑制率[8]。扭体抑制率（%） =（模型组小鼠15 min 内平均扭体次数－给药组小鼠15 min 内平均扭体次数）/模型组小鼠15 min 内平均扭体次数×100%。

1.5.4 HPLC 指纹图谱建立（1）供试品溶液制备

取“1.5.1”项下预留威灵仙干粉，精密称取0.4 g，置于100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声30 min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过0.45 µm 微孔滤膜，即得[9]。

（2）色谱条件 Diamonsil Plus C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脱（0 ～8 min，95%～95%B；8 ～15 min，95%～88%B；15 ～40 min，8%～80%B；40 ～60 min，80%～75%B；60 ～70 min，5%～70%B；70 ～80 min，70%B；80 ～95 min，70% ～55%B；95 ～110 min，55%～10%B；110 ～115 min，10%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：205 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL[10]。

（3）方法学考察取S1 供试品溶液，按“1.5.4（2）”项下色谱条件进样，重复6 次，计算各共有峰的相对保留时间、共有峰峰面积及色谱图的相似度，考察设备精密度；取S1 供试品溶液，分别在制备后的0、2、4、8、12、16、24 h 时，按“1.5.4（2）”项下色谱条件进样，计算各共有峰的相对保留时间、共有峰峰面积及色谱图的相似度，考察24 h 内样品稳定性；取0.1 g 的S1 药材干粉6 份，按上述方法操作，制备供试品溶液，按“1.5.4（2）”项下色谱条件进样，计算各共有峰的相对保留时间、共有峰峰面积及色谱图的相似度，考察方法重复性。

1.5.5 统计学方法用SPSS17.0 软件进行数据分析，计量资料用均数 ± 标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P< 0.05 为差异具有统计学意义。偏最小二乘回归分析采用MINITAB 17 软件。

2 结果

2.1 抗炎镇痛作用结果

与模型组比较，阿司匹林组及各批次威灵仙组均明显降低小鼠耳肿胀度（P< 0.05），提高肿胀抑制率（P< 0.05），减少扭体次数率（P< 0.05），增强扭体抑制率（P< 0.05）。结果见表2。

表 2 各组小鼠抗炎镇痛实验结果（±s，n = 10）Tab.2 Experimental results of anti inflammation and analgesia in mice of each group（±s，n = 10）

注：与空白组比较，#P ＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.05。

扭体抑制率/%空白组 0.24 ± 0.09 100.00 ± 0.09 0.0 ± 0.00 100.00 ± 0.00模型组 98.13 ± 11.18# 0.0 ± 0.00# 40.25 ± 3.50# 0.0 ± 0.00#阿司匹林组 48.31 ± 2.49*# 50.77 ± 2.54*# 9.75 ± 2.99*# 75.78 ± 7.42*#S1 组 52.43 ± 3.31*# 46.57 ± 3.37*# 13.20 ± 3.19*# 67.20 ± 7.94*#S2 组 60.24 ± 3.94*# 38.61 ± 4.02*# 14.40 ± 2.88*# 64.22 ± 7.16*#S3 组 51.83 ± 3.98*# 47.18 ± 4.06*# 12.67 ± 3.21*# 68.53 ± 7.99*#S4 组 49.55 ± 4.01*# 49.51 ± 4.09*# 10.00 ± 2.58*# 75.16 ± 6.42*#S5 组 49.15 ± 7.02*# 49.92 ± 7.15*# 16.33 ± 2.94*# 59.42 ± 7.31*#S6 组 53.11 ± 3.86*# 45.88 ± 3.94*# 9.60 ± 3.05*# 76.15 ± 7.58*#S7 组 58.53 ± 7.34*# 40.36 ± 7.48*# 12.20 ± 2.59*# 69.69 ± 6.43*#S8 组 50.88 ± 5.29*# 48.15 ± 5.39*# 15.80 ± 2.39*# 60.75 ± 5.93*#S9 组 57.05 ± 3.18*# 41.87 ± 3.24*# 10.50 ± 2.65*# 73.91 ± 6.57*#S10 组 56.33 ± 2.92*# 42.60 ± 2.98*# 14.20 ± 2.39*# 64.72 ± 5.93*#S11 组 50.89 ± 3.93*# 48.14 ± 4.00*# 11.00 ± 2.58*# 75.16 ± 6.41*#F 58.101 58.101 40.005 40.005 P 0.000 0.000 0.000 0.000组别耳肿胀度/% 肿胀抑制率/%15 min 内扭体次数/次

2.2 方法学考察结果

精密度考察结果显示各共有峰的相对保留时间RSD < 0.6%，共有峰峰面积RSD < 1.0%，色谱图的相似度大于 0.99，表明设备精密度良好；稳定性考察结果显示各共有峰相对保留时间RSD < 0.9%，共有峰面积RSD < 1.3%，色谱图相似度大于 0.99，表明24 h 内样品稳定性良好；重复性考察结果显示各共有峰相对保留时间RSD < 0.8%，共有峰面积RSD <1.2%，色谱图相似度大于 0.99，表明方法重复性良好。

2.3 HPLC 指纹图谱建立

取“1.5.4”项下供试品溶液，在“1.5.4”项下色谱条件下测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012 版）”进行共有峰的匹配，得到指纹图谱，对各色谱峰进行平滑、去噪、峰对齐后，生成对照指纹图谱，见图1，共标记23 个共有峰。与对照图谱比较，11 批样品图谱相似度在0. 653 ～0.975 之间，相似度结果见表3。

图1 2 批对照药材及11 批样品HPLC 指纹图谱Fig. 1 The HPLC fingerprint of 2 batches of control herbs and 11 batches of samples

表3 2 批对照药材及11 批样品指纹图谱相似度Tab. 3 The fingerprint similarity of 2 batches of control herbs and 11 batches of samples

2.4 谱效关系分析

考虑威灵仙各批次药材相似度较低，为了更全面的反映化学成分与药效之间的关系，因此在23 个共有峰的基础上，又在对照图谱上选择峰面积占比大于0.5%的15 个特征峰进行谱效关系分析，38 个特征峰保留时间见表4。以38 个特征峰的峰面积作为自变量（X），编号为X1、X2、X3…X38，各批次威灵仙肿胀抑制率或扭体抑制率作为因变量（Y），将数据分别代入MINITAB 17 软件，建立偏最小二乘回归方程，得到特征峰与肿胀抑制率或扭体抑制率之间的回归方程，肿胀抑制率Y= - 0.033 8X1- 0.122 7X2+ 0.058 4X3- 0.050 9X4+ 0.059 7X5+ 0.065 3X6+ 0.051 4X7+0.093 4X8+ 0.032 5X9+ 0.023 8X10+ 0.015 9X11+ 0.013 4X12-0.060 8X13- 0.131 3X14+ 0.004 3X15- 0.169 4X16+0.023 6X17+ 0.072 2X18- 0.027 8X19- 0.211 5X20-0.073 0X21+ 0.320 3X22+ 0.027 7X23+ 0.038 0X24+0.008 8X25- 0.013 2X26+ 0.007 3X27- 0.090 3X28+0.1 480X29- 0.109 5X30+ 0.144 9X31+ 0.083 0X32-0.120 9X33- 0.080 5X34+ 0.025 1X35- 0.191 5X36+0.031 1X37- 0.000 5X38（R2= 0.959 5）；扭体抑制率Y= - 0.151 5X1- 0.119 8X2- 0.077 1X3- 0.183 9X4-0.082 8X5- 0.043 8X6+ 0.075 8X7+ 0.008 6X8- 0.009 0X9+0.057 0X10+ 0.073 9X11+ 0.030 5X12+ 0.143 7X13+ 0.067 0X14+0.007 4X15+ 0.101 9X16+ 0.136 6X17+ 0.022 8X18-0.045 5X19- 0.054 1X20+ 0.023 3X21- 0.136 4X22-0.037 1X23+ 0.013 4X24+ 0.005 8X25- 0.192 9X26+0.012 1X27- 0.051 1X28- 0.063 4X29- 0.116 5X30+0.083 0X31+ 0.146 7X32- 0.085 2X33- 0.023 0X34+0.090 7X35+ 0.226 3X36- 0.006 8X37+ 0.048 7X38（R2= 0.973 8）。其中，各项系数代表对应特征峰对药效的贡献大小，绝对值越大对药效贡献越大，正值代表与药效正相关，负值代表与药效负相关，偏最小二乘回归模型回归系数见图2。结果可见，与抗炎作用呈较大（相关系数绝对值≥01，下同）正相关的特征峰有3 个，为P22 ＞P29 ＞P31，呈较大负相关的特征峰有7 个，为P20 ＞P36 ＞P16 ＞P14 ＞P2 ＞P33 ＞P30；与镇痛作用呈较大正相关的特征峰有5个，为P36 ＞P32 ＞P13 ＞P17 ＞P16，呈较大负相关的特征峰有6 个，为P26 ＞P4 ＞P1 ＞P22 ＞P2 ＞P30。

表4 特征峰保留时间Tab. 4 Retention time of characteristic peaks

3 讨论

3.1 提取条件及色谱条件的选择

由于2020 年版《中国药典》中对威灵仙定量分析提取方法的要求较为繁琐，相当于是对齐墩果酸的富集，图谱成分简单，不可用于指纹图谱分析。因此，本研究参考文献[9-10]对比了不同浓度甲醇及不同浓度乙醇的提取效率，结果显示100%甲醇提取液的HPLC 色谱峰相对较多，且峰高相对均衡，因此采用100%甲醇作为提取液。由于威灵仙中成分主要为皂苷类，故文献中多选205 ～210 nm 作为检测波长，本研究对威灵仙及棉团铁线莲对照药材供试品溶液进行紫外全波长扫描，均在205 nm 处呈最大吸收，故选择205 nm 作为检测波长。针对流动相，本研究对比了乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水，结果发现以乙腈-水作为流动相各色谱峰略微拖尾，而以乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水作为流动相各色谱峰峰形较好，且无差别，故选择乙腈-0.05%磷酸水作为流动相。

图 2 特征峰标准化系数Fig. 2 Characteristic peak standardization coefficient

3.2 抗炎镇痛作用谱效关系分析

结果显示，有3 个特征峰与抗炎作用呈较大正相关，有7 个特征峰呈较大负相关，有5 个特征峰与镇痛作用呈较大正相关，有6 个特征峰呈较大负相关。表明威灵仙中的化学成分对抗炎镇痛作用既有正向调节作用也有负向调节作用。总体来看，不同基原威灵仙在抗炎与镇痛药效方面起效的物质基础之间存在较大差别。实验结果提示，在威灵仙饮片加工过程中，可针对不同用途，参考与抗炎或镇痛作用具有较大正相关的成分作为评价指标，采用不同方法及辅料对威灵仙进行合理的炮制加工，以达到提高临床治疗效果的目的。