基于决策曲线分析评估血清异常凝血酶原和甲胎蛋白在原发性肝癌中的诊断价值

朱嫦琳 陈展泽 李启欣

佛山市第一人民医院检验科（广东佛山528000）

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内位于常见癌症死亡原因的第三位［1-2］。2019年国家癌症中心发布的最新全国癌症统计数据显示，肝癌发病率位于所有恶性肿瘤第四位［3］。由于具有早期隐蔽、进展期迅速、复发率高及对化疗药物不敏感等特点，HCC 预后较差［4］。甲胎蛋白（alpha⁃fetoprotein，AFP）及维生素K 缺乏诱导的异常蛋白（protein induced by vitamin K absence or antagonist⁃Ⅱ，PIVKA⁃Ⅱ）均为临床上较常见的HCC 肿瘤标志物，而目前常用于预测肿瘤标志物对HCC 诊断价值评价的研究多采用受试者工作特征（receiver operating characteristic ROC）曲线，通过曲线下面积（area under curve，AUC）评判不同预测模型的优劣，存在一定的不足。决策曲线分析法（decision curve analysis，DCA）是一种评价诊断方法或预测模型净受益的方法，主要关注临床效用问题［5］，是ROC曲线的一个良好的补充。本研究同时采用ROC及DCA方法评价PIVKA⁃Ⅱ和AFP单独及联合检测对原发性HCC的诊断价值，报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2016年5月至2020年7月期间于佛山市第一人民医院门诊及住院患者、体检健康者标本共982 例，按研究目的分为以下6 组：（1）原发性肝细胞癌组（肝细胞癌组）：经本院病理确诊且在本院初诊为原发性HCC 患者共285 例，均为乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性。根据国际抗癌联盟和美国癌症联合委员会（International Union for Cancer Control/American Joint Committee on Cancer，UICC/AJCC）发布的第七版TNM 肿瘤分期标准，其中202例具备完整TNM 分期资料；（2）慢性乙型肝炎组（肝炎组）：均为HBsAg阳性且经临床确诊为慢性乙型肝炎患者，并排除发生肝硬化的患者，共266 例；（3）肝硬化组：均为HBsAg 阳性且经临床确诊为肝硬化患者共223 例；（4）肝内胆管细胞癌组（肝胆管癌组）：经本院病理确诊的肝内胆管细胞癌患者共23 例；（5）肝部继发性恶性肿瘤组（肝继发瘤组）：经本院病理确诊的肝部继发性恶性肿瘤患者共17 例；（6）正常对照组：于本院体检中心体查指标无异常，且经B 超排除腹部疾病者共168 例。所有入选对象在采血前半年内均未服用维生素K 制剂及维生素K 拮抗类药物，均排除严重血液疾病、合并其他肿瘤患者。本研究经过佛山市第一人民医院医学伦理委员会讨论批准后实施，所有入选对象均知情同意。研究对象一般资料见表1。

表1 研究对象一般资料Tab.1 General information of subjects

1.2 诊断标准原发性肝细胞癌诊断依据为《原发性肝癌诊疗规范（2017年版）》［6］。慢性乙型肝炎诊断依据《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》［7］。肝硬化诊断依据为《2015JSGE 循证临床实践指南：肝硬化》［8］。肝内胆管细胞癌诊断依据病理学检查结果。肝部继发性恶性肿瘤诊断结合肝外肿瘤的病理学确诊及影像学资料。

1.3 方法

1.3.1 血清样本采集1-5 组受试者在用药或治疗前清晨空腹采集血样，6 组受试者在体检当天清晨空腹采集血样，采用带分离胶促凝真空采血管采集静脉血3 mL，3 000 r/min 离心15 min，取上层血清用于PIVKA⁃Ⅱ和AFP 测定，所有测定于采血当日完成。

1.3.2 仪器与试剂PIVKA⁃Ⅱ检测采用采用LU⁃MIPULSETM G1200 全自动化学发光免疫分析系统及其配套的异常凝血酶原（PIVKA⁃Ⅱ）检测试剂盒（化学发光法）、标准品及质控品（日本富士瑞必欧株式会社）。AFP 检测仪器采用Cobas E602 电化学发光免疫分析仪及配套试剂、标准品和质控品（Roche）。检测系统所有性能参数均通过实验室性能验证，所有操作严格按照厂家提供的操作说明书进行，以40 mAU/mL 和20 ng/mL 作为PIVKA⁃Ⅱ和AFP 的参考范围上限，超过上限值判断为阳性（+），反之为阴性（-）。

1.4 统计学方法统计学分析采用SPSS 25和Gra⁃phPad Prism 8。计量资料采用Kolmogorov⁃Smirnov（K⁃S）检验进行正态性检验后，计量资料采用均值±标准差或M（P25，P75）表示。多组间比较采用Kruskal⁃Walls 检验，组间两两比较采用Mann⁃Whit⁃neyU检验。计数资料组间比较采用χ2检验。ROC曲线分析采用Medcalc 软件。决策曲线分析与临床影响曲线的绘制采用R 语言3.5.1 软件Deci⁃sion Curve包。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清PIVKA⁃Ⅱ和AFP水平比较6组研究对象血清PIVKA⁃Ⅱ和AFP 水平比较，6 组间PIVKA⁃Ⅱ和AFP 水平差异有统计学意义（P<0.001）。经两两比较，肝细胞癌组患者PIVKA⁃Ⅱ水平和AFP 水平均高于其他各组（P< 0.001），肝炎组患者PIVKA⁃Ⅱ水平和AFP 水平均高于对照组（P< 0.001），肝炎组AFP 水平高于肝继发肿瘤组（P< 0.05），肝硬化组患者AFP 水平高于对照组（P< 0.001），其余各组水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 各组血清PIVKA⁃Ⅱ和AFP 水平比较Tab.2 Comparison of serum PIVKA⁃Ⅱand AFP levelsM（P25，P75）

2.2 各组血清PIVKA⁃Ⅱ和AFP 水平上升情况比较6组研究对象血清PIVKA⁃Ⅱ和AFP水平上升情况比较，肝细胞癌组、肝炎组及肝硬化组PIVKA⁃Ⅱ和AFP 增高不一致所占比例分别为35.44%、33.08%、35.43%，而在肝胆管癌组、肝继发瘤组及正常对照组两个指标上升不一致所占比例分别为15.40%、5.88%及10.71%。见表3。

表3 各组血清PIVKA⁃Ⅱ和AFP 水平上升情况比较Tab.3 Positive rates of serum PIVKA⁃Ⅱand AFP例（%）

2.3 ROC 曲线分析分别以所有非肝癌者（肝炎组、肝硬化组、肝胆管癌组、肝继发肿瘤组、正常对照组）为对照组、肝细胞癌组为病例组以及以健康人群为对照组绘制ROC 曲线，比较血清PIVKA⁃Ⅱ和AFP 单项及联合检测诊断原发性HCC 的AUC，结果显示，PIVKA⁃Ⅱ的AUC 优于AFP，与两者联合检测基本一致，见图1-2。各种方法对HCC 的诊断性能比较见表4。

表4 PIVKA⁃Ⅱ及AFP 单项检测及联合检测诊断性能比较Tab.4 Comparison of diagnostic performance of single and joint detection of PIVKA⁃Ⅱand AFP

图1 以非肝癌者为对照组Fig.1 Patients without HCC as the control group

图2 以健康人群为对照组Fig.2 Healthy controls as control group

2.4 决策曲线分析利用决策曲线分析进行不同模型的比较，见图3。结合年龄及性别因素，PIVKA⁃Ⅱ与AFP 联合检测对原发性HCC 的诊断价值优于AFP，除了风险阈值为0.24 ~ 0.25 时［联合检测成本效益比vs.单独PIVKA⁃Ⅱ检测成本效益比为（0.501~0.478）vs.（0.642~0.524）］，联合检测对HCC 的诊断价值均优于PIVKA⁃Ⅱ单独检测。

图3 决策曲线分析PIVKA⁃Ⅱ和AFP 单独或联合检测对HCC 的诊断性能Fig.3 Diagnostic performance of PIVKA⁃Ⅱand AFP in HCC by decision curve analysis

2.5 临床影响曲线分析进一步对两个指标联合检测的方案做临床影响曲线分析，在各个阈值概率下，被联合检测方案划分为高风险的人数与真阳性人数，提示在阈值概率为0.2 时，两者基本达到一致（图4）。

图4 临床影响曲线验证PIVKA⁃Ⅱ和AFP 联合检测方案对HCC 的诊断价值Fig.4 Diagnostic value of PIVKA⁃Ⅱand AFP joint detection for HCC verified by clinical impact curve

3 讨论

HCC 生物标志物及治疗靶点是目前研究热点之一［9］。AFP 是临床最常用的HCC 生物标志物，可作为筛选HCC 及判断预后的指标［10］，但灵敏度较差，尤其在肿瘤< 3 cm 时常常检测不出［11-12］，在诊断早期HCC 存在一定的漏诊率。PIVKA⁃Ⅱ是一种异常的凝血酶原，在HCC 患者血清中显著升高，其诊断灵敏度和特异性均较高［13-14］。本研究共纳入982 例受试者，根据其疾病类型分成肝细胞癌组、肝炎组、肝硬化组、肝胆管癌组、肝部继发肿瘤组及正常对照组，结果显示，肝细胞癌组无论PIVKA⁃Ⅱ水平还是AFP 水平均显著升高，提示这两个指标与原发性HCC 密切相关，与报道基本一致［15-16］。对于PIVKA⁃Ⅱ，除了HCC 组显著升高以外，其他组未见显著升高，尤其在肝胆管癌和肝部继发肿瘤患者中，提示PIVKA⁃Ⅱ对于原发性HCC与其他类型的肝脏肿瘤具有很好的鉴别诊断价值。对于AFP，除肝细胞癌组外，其他组别患者升高不明显，虽然肝炎组和肝硬化组AFP 水平与对照组比较差异有统计学意义，但绝大部分患者均处于正常参考区间内，表明AFP 诊断原发性HCC的特异性良好。

PIVKA⁃Ⅱ和AFP 产生机制不同，因此本研究对PIVKA⁃Ⅱ增高但AFP 无显著增高、以及AFP 增高但PIVKA⁃Ⅱ无显著增高的人群进行分析，发现在肝细胞癌组中，PIVKA⁃Ⅱ增高但AFP 无显著增高的所占比例高达29.12%。文献指出，在临床中，以> 20 ng/mL 作为截断值时，AFP 的灵敏度只能达到约50%［11］，本研究结果亦显示在肝细胞癌组、肝炎组及肝硬化组PIVKA⁃Ⅱ和AFP 增高不一致所占比例均超过30%，提示两个指标不存在相关性，两者联合检测可大大提高早期肝癌的诊断率。

ROC 曲线是用于预测模型评价的重要方法之一，主要通过AUC 同时计算灵敏度和特异性评判不同预测模型的优劣［17］。本研究结果显示，在采用非原发性HCC 患者作为对照组时，PIVKA⁃Ⅱ的AUC 与联合检测基本一致，均显著优于AFP，当采用正常健康人群作为对照组时，联合检测的AUC为最优，其次为PIVKA⁃Ⅱ，AFP 最差，但联合检测的AUC与PIVKA⁃Ⅱ差异不大。PIVKA⁃Ⅱ在不同的研究中所报道的灵敏度差异较大，是否能单独作为原发性HCC 的诊断指标仍存在较大争议［18-19］。而本研究结果则表明PIVKA⁃Ⅱ无论作为体检人群的肝癌筛查指标，还是作为肝脏疾病患者HCC 的鉴别诊断指标，都具有良好的灵敏度和特异性，可以单独作为原发性HCC 的诊断指标。

然而在某些严重疾病中，假阴性导致的漏诊可能危及生命，比假阳性更应该避免。DCA 通过引入阈值概率进行变量替换的方法，评价诊断方法或预测模型的净受益，无需获得医疗措施的具体获益及患者的主观偏好，对所有可能的行为及结果进行分析，指导临床工作者选取最有利于患者的行为决策，寻找净受益最大的方法［20-21］。由于目前原发性HCC 患者早期诊断仍存在较大困难，虽然多种标志物联合检测虽有利于提高灵敏度，但无疑也增加了患者的经济负担，同时提高了假阳性。目前文献报道的关于HCC 血清标志物联合检测方案的研究，大多采用ROC 分析方法，仅考虑检测方案的准确性，并未关注预测信息应用于临床时可能导致的后果，例如诊断出现假阳性时患者可能需要进行肝脏穿刺进行病理学检查，增加了患者不必要的痛苦和经济负担，或出现假阴性导致原发性HCC 的漏诊从而延误患者的治疗。本研究利用DCA 方法，分别对三种预测模型进行分析比较，结果显示，结合年龄和性别因素时，在任何风险阈值下，联合检测对原发性HCC均优于AFP，除了风险阈值为0.24 ~ 0.25 时，联合检测对原发性HCC 的诊断价值也优于PIVKA⁃Ⅱ单独检测。这与ROC 分析结果不完全一致，认为在进行HCC 早期筛查及诊断时，应综合考虑患者的性别、年龄、PIVKA⁃Ⅱ及AFP 水平进行分析，而非从单一指标的水平进行诊断或排除，与文献报道一致［22-23］。

综上，原发性HCC 患者血清PIVKA⁃Ⅱ与AFP水平均显著升高，两者均为诊断原发性HCC 的良好生物标志物，在进行原发性HCC 早期筛查和早期诊断时，应结合患者性别、年龄、PIVKA⁃Ⅱ及AFP 水平等因素进行综合分析，为下一步的治疗提供重要的参考依据。然而，本研究存在一定的不足，病例收集采用连续纳入方法，由于HCC男女发病比例的差异，导致性别组成比悬殊，此外由于肝内胆管癌及肝内继发性肿瘤发病率较低，在研究期间收集到的病例数较少等，以后的研究中应加大样本量或开展多中心研究进行验证。