耐碳青霉烯药鲍曼不动杆菌耐药性及相关耐药基因研究

崔颖鹏 冯冰 彭雅琴 黄汉 伍众文 廖康

中山大学附属第一医院医学检验科（广州510080）

鲍曼不动杆菌是一种非发酵、革兰氏阴性的条件致病菌，可引起组织及伤口感染、血流感染、呼吸道感染、脑膜炎等［1］。随着抗生素的普遍使用，导致多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌的出现，而碳青霉烯类抗生素作为治疗鲍曼不动杆菌的特效药物，近年发现其耐药性增加明显［2］。鲍曼不动杆菌的耐药机制主要是碳青霉烯酶的产生等［3］，该酶能够显著水解亚胺培南或美洛培南的β⁃内酰胺酶，Ambler（即Frere β 酶）分为A、B、C、D 4 类，目前在鲍曼不动杆菌中发现A、B、D 类，具体为Ambler A 类碳青霉烯酶（KPC 等）、B 类β⁃内酰胺酶（IMP 等）、D 类OXA 酶（OXA⁃23 等）。本研究主要对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌进行表型分析，利用聚合酶链式反应（即PCR 技术）检测碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌的耐药基因，了解耐药基因的分布及其与耐药菌株的相关性，为有效防控该类菌群耐药基因型流行提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源收集2019年12月至2020年10月中山大学附属第一医院住院患者分离鉴定的对亚胺培南及美罗培南耐药的鲍曼不动杆菌96 株，剔除同一患者重复菌株。

1.1.2 主要仪器与试剂PCR扩增仪（Veriti，ABI）；Fusion 凝胶成像仪（Vilber Louramt FusionFX）；HF⁃safe⁃TE 1500 生物安全柜（上海力新仪器有限公司）；VITEK⁃2 细菌鉴定仪（梅里埃生物有限公司）；GN 鉴定卡及GN335 药敏卡（法国生物梅里埃公司）；金属浴⁃V02（Vilet Biosciences）；高速离心机（himac）；移液枪（Eppendorf）；枪头和EP 管（Axy⁃gen）；微波炉（Galanz）；天平（METT，AB204⁃S）；干式恒温仪（奥胜，MK⁃2000⁃2S）；DYY⁃6C 电泳仪（北京市六一仪器厂）；PCR Mix（DSBIO）；琼脂糖（BIOWEST）；Good View（北京赛百盛基因技术有限公司）；血平板、MH平板（法国生物梅里埃公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养将耐药鲍曼不动杆菌菌株划线于血平板上复苏，37 ℃下培养24 h。24 h 后刮取菌苔3~4 环到菌株保存管，-20 ℃下保存，复苏菌株用血平板进行二次培养用于核酸提取。

1.2.2 细菌基因DNA 提取煮沸提取法：将菌株传菌后，用一次性接种环挑取2 ~ 3 环到装有300 μL 双蒸水的EP 管中，置金属浴于100 ℃下加热15 min，15 min 后放置碎冰块中5 min，最后12 000 r/min 离心3 min，取上清液即DNA 模板。

1.2.3 碳青霉烯酶表型检测使用改良Hodge 试验，将大肠埃希菌的质控菌株（ATCC 25922）用生理盐水调为0.5 麦氏的菌液涂抹整个MH 平板，将美罗培南药敏纸片贴在MH 平板中间，再使用一次性接种环挑取1 ~ 2 环待测菌株在纸片边缘沿着平板边缘划线。孵箱37 ℃孵育24 h 后观察结果。

1.2.4 酶抑制试验在MH 平板上均匀涂布0.5 麦氏单位的被测菌株，贴上四张美罗培南纸片，一张纸片空白，另外三张纸片分别单独加入10 μL 硼酸、10 μL EDTA、10 μL 硼酸+EDTA 复合物，37 ℃孵育24 h 后观察结果。

1.2.5 鉴定及药敏试验本次实验药敏由VITEK⁃2细菌鉴定仪进行鉴定药敏试验。药敏判断标准参照CLSI M100⁃S30 药敏试验指南。

1.2.6 PCR 扩增耐药基因PCR 技术扩增耐药基因反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，最后72 ℃延伸10 min，共35 个循环。反应体系为：DNA 模板3 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DS Mix 16 μL、超净水4 μL，共25 μL。引物序列由上海生工生物有限公司合成，具体引物和扩增反应体系及条件见参考文献［4-6］。基因的引物序列及长度见表1。

表1 基因的引物序列及长度Tab.1 Primer sequence and length of gene

1.2.7 凝胶电泳成像制备1.2%琼脂糖凝胶板，取0.5×TBE 80 mL 及琼脂糖粉0.96 g 倒入100 mL锥形瓶中，置微波炉中加热至煮沸，再加5 μL 的Good view，摇匀后倒入已插好梳子的胶板，冷却后使用。在电压120 V 条件下跑胶45 min，电泳结果经Fusion 成像仪观察。

2 结果

2.1 标本类型及科室分布下呼吸道标本59 株，静脉血18 株，引流液8 株，尿液4 株，分泌液4 株，组织3 株；其中ICU 标本菌株75 株（78%），康复医学科5 株、神经科5 株，烧伤外科4 株，器官移植3株，其余分布在脊柱外科、消化内科、肾内科和全科医学科各1 株。

2.2 表型检测结果在收集的96 株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌菌株中，碳青霉烯酶阳性69 株（71.9%），阴性菌株27 株（28.1%）。见图1。

图1 碳青霉烯酶表型检测Fig.1 Carbapenemase phenotype detection

2.3 酶抑制试验结果对检出的3 株KPC 耐药基因进行酶抑制试验，结果显示3 株菌株皆表现为不可被硼酸抑制，在EDTA 及硼酸+EDTA 均发现抑菌圈，在复合试剂的抑菌圈稍微大于EDTA，但其与空白对照的抑菌圈都< 5 μm。酶抑制试验与表型不符，可能是因为存在复合耐药机制的原因，也可能是酶抑制试验只适用于肠杆菌属而不适用于鲍曼不动杆菌的酶型鉴定，另外将KPC 基因产物经上海生工测序，证实为KPC 型酶。KPC 基因PCR 产物的双相测序结果与GENEBANK 中的KPC序列相一致。见图2。

图2 酶抑制试验Fig.2 Enzyme inhibition test

2.4 96 株鲍曼不动杆菌药物敏感性本次药敏试验对头孢类、四环素类、氨基糖苷类、磺胺类及β⁃内酰胺酶抑制剂等药物进行药敏试验，结果显示在所研究的菌株中，其对各类抗菌药物的耐药水平在一个相对高的水平。联合用药对治疗CRAB作用不大，替加环素和多粘菌素作为碳青霉烯类耐药后的后备选择药物，也出现了耐药现象。本次研究的菌株中对多粘菌素的耐药率为1.1%，而替加环素的耐药率为4.2%，存在25%碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感性降低。药敏结果见表2。

表2 CRAB 药物敏感性情况Tab.2 Drug sensitivity of carbapenem⁃resistant Acinetobacter baumannii

2.5 基因检测结果在筛选出的96株CRAB菌株中，检出KPC 3 株（3%），OXA⁃23 95 株（99%），OXA⁃51 93株（96.9%）。其余基因GES、SIM、NDM、OXA⁃24、OXA⁃58 等均未检出。见图3-5。

注：M，DL2000 marker

图4 OXA⁃23 检测结果Fig.4 OXA⁃23 test results

图5 OXA⁃51 检测结果Fig.5 OXA⁃51 test results

3 讨论

《2019年全国细菌耐药监测报告》显示，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药率全国平均为56%，对亚胺培南和美罗培南耐药率分别为55.5%和57.1%［7］。本研究中CRAB 临床分离出的菌株主要分布在ICU 病房，占78%。且以呼吸道标本为主。96 株菌株中有18 株来自静脉血，提示CRAB引起的血行感染占据一定比例，鲍曼不动杆菌可以在医院环境长期存活，并且极易在危重患者中引起继发感染，且大多数被感染的患者都是患有危重疾病或身体抵抗力弱等基础疾病的患者，以及使用多种侵入性操作和长期接受广谱抗生素治疗的患者［8］。

96 株CRAB 药敏实验中，除对亚胺培南及美罗培南耐药，还对环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸均耐药，复方新诺明、头孢吡肟、妥布霉素、头孢哌酮/舒巴坦、左旋氧氟沙星、多西环素、头孢他啶的耐药率均在80%以上，属于极高的耐药率。就环丙沙星而言，在浙江某家医院报道其耐药率为32%［9］，与本院的耐药水平相差略大，与山东、湖北和泰国相关医院文献中报道的耐药水平一致［10-11］，都表现为较高的耐药水平。鲍曼不动杆菌对替加环素及多粘菌素耐药现象的出现也要引起注意，目前替加环素联合其他药物并未明显降低患者28 d 病死率改善预后［12］，对于CRAB 的治疗需更多的临床资料，警惕菌株对替加环素及多粘菌素药物耐药广泛流行，适度合理使用抗菌药物。各个地区耐药水平的差异与该院的医疗器械水平、经济状况、抗生素使用情况等诸多方面有关，比如CRAB 在ICU 病房的检出率最高，抗生素的滥用、患者基础疾病影响、器械通气等［13］因素都会导致抗生素耐药现象出现。环境因素也是鲍曼不动杆菌传播的原因之一，这也要求临床在操作中落实无菌操作，避免交叉感染。

本研究对A 类碳青霉烯酶（KPC、GES）、B 类β⁃内酰胺酶（IMP、VIM⁃1、VIM⁃2、SIM、NDM）、D 类OXA 酶（OXA⁃23、OXA⁃24、OXA⁃51、OXA⁃58、OXA⁃143）进行耐药基因的检测，发现OXA⁃51阳性93株，OXA⁃23阳性95株，3株KPC耐药基因。说明本院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药与产OXA⁃51 型酶和OXA⁃23 型酶有关，与国内外流行情况一致，都表现为高OXA⁃23、OXA⁃51 的检出率。OXA⁃51 为鲍曼不动杆菌本身携带的基因，本研究中其在CRAB的检出率96.9%，未达到100%检出率，将OXA⁃51阴性的菌株经质谱技术鉴定为鲍曼不动杆菌，排除其菌株为皮特鲍曼不动杆菌的可能性，所以这3 株CRAB 可能受插入序列ISAbal 的影响，ISAbal 低表达或弱表达都会影响耐药基因的出现，OXA⁃51 与gyrB 多重PCR 鉴定方法相比特异性低［14］。本院CRAB 最主要流行的耐药基因为OXA⁃23，其检出率达99%，中国地区的CRAB 80%产OXA⁃23 型酶［15］，在未来发展中OXA⁃23 型耐药基因会不会成为CRAB 的耐药基因流行传播需持续监控。宋志伟等［9］对CRAB 进行耐药机制研究时还检出VIM 耐药基因，以及高东田等［10］在研究鲍曼不动杆菌时检出OXA⁃58 型酶。耐药基因bla NDM 在埃及和阿尔及利亚地区被报道［16］。不同地区所报道的耐药基因类型有所异同，与地域差异性有关。葡萄牙某家医院［17］在同一患者身上分离出的CRAB 和肺炎克雷伯杆菌同时检出了blaKPC⁃3耐药基因，而且其研究表明这两种菌株有着相同的IncFrepB 复制源，证明了两种分离株间可以通过质粒水平进行种间传播。CANEIRAS 等［17］研究分析的多重耐药鲍曼不动杆菌菌株中检出耐药基因KPC 亚型。从上述研究来看，国内外不同区域耐药基因的流行情况因地域的不同而存在差异，各个地区除了防止本地流行菌株的暴发外，预防外来耐药基因的侵入也是需重点关注的方面。

另外耐药KPC 菌株在本研究中，除对粘菌素敏感外，对于其他药物如环丙沙星、多西环素、头孢吡肟、米诺环素、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明、替加环素等抗生素均表现为耐药或中介，这导致临床在药物治疗的选择方面存在很大的局限性［18］。周洋等［19］研究发现替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦治疗多重耐药鲍曼不动杆菌肺炎的疗效显著，联合用药显得更加重要。与此同时，3 株KPC 阳性菌株还存在OXA⁃23 和OXA⁃51，为多重耐药基因菌株。

综上所述，本研究临床分离出的CRAB 主要携带OXA⁃51、OXA⁃23 耐药基因，应该对本地区碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌进行基因分析，确定是否存在KPC 耐药基因的流行情况，及时采取措施，防止其在医院内广泛传播。鲍曼不动杆菌对抗生素耐药的因素有很多，比如外膜蛋白的改变、主动外排泵过表达及药物作用靶点的变化［20］，都可影响抗生素在体内的杀菌活性，从而引起细菌耐药。本研究对CRAB 的耐药基因进行研究，了解本院耐药基因的分布，能更好为临床治疗提供依据。本研究不足之处在于标本量少，未全面收集广州各个医院的菌株进行研究，仅局限于本院一两年内临床分离的菌株。同时下一步还需进行菌株的同源性分析，掌握流行克隆的传播情况不容小视。