基于多工具的山羊circRNA-miRNA靶向关系分析

陶 虎，杨 娟，许铭洙，刘泽林，张 年，刘 洋，陈明新*

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064；2.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010）

CircRNA 是一类以共价键首尾连接成环的非编码RNA 分子，在结构上不包含5'端帽子和3' poly A 尾。自1976 首次发现以来，circRNA 一直被认为是转录的副产物，并无生物学功能[1]。随着高通量测序技术的兴起，大量circRNA 在各类生物体内被发现，研究人员也逐渐揭示了circRNA 在各种生命过程中发挥的重要调控作用。CircRNA 的环状结构具有很高的稳定性，可以作为各类癌症的标志物[2]；Piwecka 等人[3]研究发现，circRNA Cdr1as 能调控哺乳动物大脑中的miRNA 水平，缺失会导致小鼠出现神经元异常和行为障碍；山羊中新发现的circ_ZCCHC24 可以促进山羊卵泡颗粒细胞的增殖[4]。CircRNA 主要有4 种作用机制：1）竞争性吸附miRNA，调控其靶基因的表达[5]；2）调节RNA 结合蛋白，可作为蛋白分子的海绵体[6]；3）与RNA 聚合酶II 相互作用，调控基因转录[7]；4）编码蛋白质发挥功能[8]。本研究前期以高低繁殖力的麻城黑山羊为研究对象，分析高低产羔数山羊排卵前卵泡中circRNA 的表达情况，筛选出差异表达的circ_0008219 作为调控山羊卵泡发育的候选因子，拟下一步开展深入研究[9]。

MiRNA 靶标预测工具众多，在动物中常用的工具包括miRWalk[10]、PicTar[11]、miRanda[12]、Targetscan[13]、RNAhybrid[14]、PITA[15]、miRmap[16]、DIANA-microT[17]和RNA22V2[18]等，但这些工具主要针对人、小鼠等热点物种开发，其中一些预测工具参数设置有限或无法输入序列，只能通过已有数据库中选取相应ID 进行分析，这对于山羊一类家畜则无法进行靶向关系的准确预测。

本研究选择5 款支持输入序列分析的本地化miRNA靶标预测工具（miRanda、targetscan、RNAhybrid、PITA 和RNA22V2）来进行数据分析，利用山羊circ_0008219 全长序列和山羊所有miRNA 种子序列信息进行二者靶向关系的联合预测。通过对上述结果取交集，获得了10 个潜在的候选miRNA，选取其中5 个8mer site 类型进行后续研究。利用双荧光素酶报告实验发现miR-130b-5p、miR-423-3p、miR-326-3p 和miR-671-5p 可与载体靶序列结合。本研究表明利用支持序列分析的多工具对miRNA 靶标进行联合预测，具有较高的阳性率，可为circRNA 与miRNA 靶向关系预测提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 在湖北省农业科学院种羊场选择12 月龄的成年母羊，采集血液样品置于抗凝采血管中迅速带回实验室。样品利用基因组DNA 提取试剂盒（天根公司）进行提取，-20℃保存备用。

1.2 主要试剂 聚合酶PrimeSTAR®Max DNA Polymerase购自中国的宝生物工程（大连）有限公司。Ecos感受态细胞和pmirGLO 双荧光表达载体由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存；pMD18-T Vector 购自宝生物工程（大连）有限公司；限制性内切酶PmeI 和NheI、T4 DNA 连接酶购自NEB 公司；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega 公司；Dual-Luciferase®Reporter Assay System 购 自Promega 公 司；miRNA mimics 和NC 由广州锐博生物技术有限公司合成；山羊皮肤成纤维细胞由本实验室分离培养；引物序列由北京奥科生物科技公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 软件的下载与安装 miRanda v3.3a、targetscan 7.2、RNAhybrid 2.1.2、PITA 1.6 和RNA22 V2 5 款miRNA靶标预测工具均安装于linux 系统中。

1）miRanda

miRanda 的下载地址：http://cbio.mskcc.org/micror na_data/miRanda-aug2010.tar.gz

miRanda 的安装命令如下：

tar -xzvf miRanda-aug2010.tar.gz

cd/path/to/miRanda-3.3a4

./configure --prefix=/path/to/miRandada-aug2010

sudo make

sudo make install

2）Targetscan

Targetscan 的下载地址：http://www.targetscan.org/vert_72/vert_72_data_download/targetscan_70.zip

Targetscan 的安装命令如下：

unzip targetscan_70.zip

cd/path/to/targetscan_70

perl targetscan_70.pl

其中，targetscan_70.pl 为perl 脚本文件，可在perl 语言环境下运行。

3）RNAhybrid

RNAhybrid 的下载地址：https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/applications/rnahybrid/resources/downloads/RNAhybrid-2.1.2.tar.gz

RNAhybrid 的安装命令如下：

tar -xzvf RNAhybrid-2.1.2.tar.gz

cd/path/to/RNAhybrid-2.1.2

./configure

sudo make

sudo make install

4）PITA

PITA 的下载地址：http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/64bit_exe_pita_prediction.tar.gz

PITA 的安装命令如下：

tar -zxvf 64bit_exe_pita_prediction.tar.gz

cd/path/to/ 64bit_exe_pita_prediction

./configure

sudo make

sudo make install

5）RNA22V2

RNA22V2 的下载地址：https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/remoteRNA22v2.zip

RNA22V2 的安装命令如下：

unzip remoteRNA22v2.zip

cd/path/to/remoteRNA22v2

java RNA22v2

将miRNA 种子序列和circ_0008219 全长序列文件导入Parameters.properties 和RNA22v2.class 所在文件夹中，打开Parameters.properties 文件，根据注释信息修改后运行程序。

1.3.2 原始数据整理 数据均储存于txt 文档内，miRanda、RNAhybrid、PITA 和RNA22V2 4 款工具所需数据为FASTA 格式，包括2 个文件：山羊所有miRNA 种子序列文件和circ_0008219 全长序列文件。其中，山羊miRNA 的种子序列文件可从miRbase 数据库中下载，下载网址为ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa.gz。Targetscan 工具的数据格式有别于其他软件，miRNA 序列格式为“miRNAID 种子序列物种ID”，circ_0008219 的全长序列格式为“基因ID 物种ID 序列。”

1.3.3 数据分析 在linux 系统中，运行安装好的5 款工具，对miRNA 的种子序列文件和circ_0008219 的全长序列文件进行处理。程序运行方法如下：

1）miRanda 程序运行命令如下：

miranda -sc 140 -en -7 miRNA.txt circ_0008219.txt-out miRanda_result.txt

其中，-sc 指分数阈值，-en 指能量阈值。

2）Targetscan 程序运行命令如下：

Perl targetscan_50.pl miRNA.txt circ_0008219.txt targetscan_result.txt

3）RNAhybrid 程序运行命令如下：

RNAhybrid -s 3utr_human -t circ_0008219.txt -q miRNA.txt

4）PITA 程序运行命令如下：

perl pita_prediction.pl -utr circ_0008219.txt -mir miRNA.txt -prefix PITA_result

5）RNA22V2 程序运行命令如下：

java RNA22v2

上述5 款工具所得结果在Excel 2019 中进行数据汇总，然后利用Calculate and draw custom Venn diagrams工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制韦恩图、取交集。

1.3.4 载体构建 根据circ_0008219 的全长序列设计合成包含PmeI 和NheI 酶切位点的引物对Full-PF、Full-PR（表1）。以山羊DNA 为模板，利用上述引物进行PCR 扩增，产物长度为2 045 bp。PCR 扩增反应程序：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，58℃变性10 s，72℃变性20 s，共35 个循环；72℃延伸7 min；16℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，利用DNA快速纯化回收试剂盒回收目的片段。pmirGLO 质粒经双酶切线性化后切胶回收。上述2 种胶回收产物利用T4 连接酶16℃连接2 h。连接体系加入50 μLEcos感受态细胞，均匀涂布于LB 固体培养基（氨苄）上，于37℃培养箱中过夜。筛选阳性克隆送北京奥科生物科技公司测序验证，提取重组载体质粒备用。

表1 引物与探针信息

1.3.5 细胞培养与转染 山羊皮肤成纤维细胞由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所分离保存，细胞培养基为DMEM-F12 中加入10% 的胎牛血清，培养箱设置为5%CO2、37℃。待细胞培养至80%的融合度，使用胰酶消化后均匀接种于24 孔细胞培养板中。每孔加入2 μL 的lipofectmin 3000、0.2 μL mimics 和1/20 μgpmir-8219 双荧光载体质粒共转染于细胞，24 h 后提取蛋白，利用Dual-Luciferase®Reporter Assay System 在多功能酶标仪中检测相对荧光活性。

2 结果

2.1 与circRNA 靶向结合的miRNA 预测 利用miRanda、targetscan、RNAhybrid、PITA 和RNA22V2 等5 款miRNA 靶标预测工具来进行山羊circ_0008219 序列中miRNA 靶位点的预测，结果发现miRanda 有68 个miRNA 结合，targetscan 有308 个，RNAhybrid 有47 个，PITA 有174 个，RNA22V2 有333 个，上述结果取交集后，共得到10 个miRNA 与circ_0008219 结合（图1A），13 个结合位点信息（图1B）。

图1 circ_0008219 与miRNA 互作结果

如表2 所示，预测结果中包含8mer site 和7mer-m8 site 2 种匹配类型，属于8mer site 类型的有：miR-423-3p、miR-330-5p、miR-326-3p、miR-671-5p 和miR-130b-5p。属于7mer-m8 site 类型的有：miR-485-5p、miR-483、miR-330-5p、miR-326-3p、miR-130b-5p、let-7g-3p、miR-1343 和miR-29b-5p。此外，miR-330-5p、miR-326-3p 和miR-130b-5p 同时具有8mer site 和7mer-m8 site 2 种匹配类型。8mer site 的特异性高，假阳性率低于7mer-m8。

表2 miRNA 匹配类型

2.2 山羊circ_0008219 双荧光素酶载体构建 为了验证预测的circRNA-miRNA 的靶向关系，利用酶切重组法构建了circ_0008219 的pmirGLO 双荧光素酶重组载体。利用PCR 扩增circ_0008219 的全长序列，长度为2 045 bp。凝胶电泳结果显示，片段长度与预期结果相符，无杂带（图2）。

图2 山羊circ_0008219 基因全长序列的扩增

山羊circ_0008219 全长序列的PCR 回收产物和双荧光素酶载体pmirGLO 质粒（图3）经PmeI 和NheI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。利用T4 连接酶连接线性化pmirGLO 质粒和circ_0008219 序列的双酶切回收产物，随后克隆转化入Ecos感受态细胞，培养过夜后挑选阳性克隆进行鉴定。将阳性菌液进行测序，序列比对结果表明，目的片段与模板序列完全一致，该载体质粒命名为pmir-8219。

图3 双荧光素酶载体pmirGLO 的模式图

2.3 候选miRNA 的验证 选取8mer site 匹配类型的miR-423-3p、miR-330-5p、miR-326-3p、miR-671-5p和miR-130b-5p 等5 个miRNA，合成mimics 和NC，与pmir-8219 载体质粒共转染于山羊皮肤成纤维细胞，检测pmir-8219 质粒的荧光活性变化。结果发现，miR-130b-5p 可以抑制pmir-8219 质粒的荧光活性（P<0.01），miR-423-3p、miR-326-3p 和miR-671-5p 则发挥抑制作用（P<0.05）（图4）。结果表明，circ_0008219 可以通过“分子海绵”作用吸附miR-130b-5p、miR-326-3p、miR-671-5p 和miR-423-3p，从而发挥调控作用。此外，也证明了利用5 款miRNA 靶标预测工具进行联合预测有较高的阳性率。

图4 候选miRNA 对pmir-8219 双荧光素酶载体荧光活性的调控

3 讨 论

近年来，非编码RNA 已成为各类生命活动中基因表达调控的明星因子，在疾病、生长发育等领域已有大量重要研究成果相继被报道[19]。CircRNA 作为ncRNA的重要成员之一，在山羊研究领域中仅在乳腺上皮细胞增殖[20]、子宫内膜容受[21]、骨骼肌发育[22]等方面有相关报道。因此，本研究前期以高繁殖力的麻城黑山羊为研究对象，分析高低产羔数山羊排卵前卵泡中circRNA的表达情况，筛选出差异表达的circ_0008219 作为候选因子拟开展深入研究[9]。

CircRNA 通过吸附miRNA 发挥调控作用是其最重要的作用形式之一。利用miRNA 靶标预测工具进行生物信息学分析是研究的关键步骤。现有的miRNA 靶标预测工具有数十种之多，分为离线型和在线型[23]。预测工具主要通过4 个方面信息来进行miRNA 的靶基因预测：1）miRNA 与靶基因之间的互补配对关系；2）靶基因的热力学稳定性；3）靶基因的物种保守性特征；4）机器学习方法[24]。但这些预测工具大多针对人、小鼠等物种开发，仍存在无法输入已知序列、参数设置较为有限、只能输入miRNA 和靶基因ID 等问题，这都导致了在进行家畜miRNA 研究过程中，只能以人或小鼠的基因来进行预测，如果同源性不高，将导致预测结果出现假阳性。

CircRNA 最常见的调控机制——“miRNA 分子海绵”需要进行互作位点的预测。CircRNA 与miRNA 互作关系预测仍然遵循miRNA 种子序列中5'端2-7nt 与circRNA 序列形成Watson-Crick 配对这一重要原则。根据上述配对的匹配情况可分为以下形式：1）8mer site：miRNA 第2-8 nt 与circRNA 序列完全配对，circRNA 序列对应miRNA 第1 nt 为A；2）7mer-m8 site：miRNA第2～8 nt 与circRNA 序列完全配对；3）7mer-1A site：miRNA 第2～7 nt 与circRNA 序列完全配对，circRNA序列对应miRNA 第1 nt 为A；4）6mer site：miRNA 第2～7 nt 与circRNA 序列完全配对[25]。匹配类型的特异性为：8mer site>7mer-m8 site>7mer-1A site>6mer site。在分析预测结果时，尽量选择8mer site 类型，以提高实验成功率。

CircRNA 与miRNA 互补配对的紧密程度直接影响其作用机制。Cdr1as 是在哺乳动物大脑中高表达的一种circRNA，可吸附miR-7 发挥重要作用[26]。随后，Piwecka 等人[3]发现Cdr1as 可以结合另一种miR-671，且miR-7 下调表达，miR-671 上调表达。Cdr1as与miR-7 不是完全互补配对，导致Cdr1as 与miR-7 结合后不会被Ago2 蛋白剪切降解，起到稳定miR-7 的作用；Cdr1as 与miR-671 完全互补配对，导致Cdr1as与miR-671 结合后被Ago2 蛋白剪切降解，无法发挥吸附作用。该研究揭示了circRNA 作为ceRNA 作用的新机制，提示研究者在选择与circRNA 靶向作用的miRNA 时，需要考虑结合的紧密程度，根据circRNA和miRNA 的表达情况，明确circRNA 的作用机制。

4 结 论

本研究选择了miRanda、targetscan、RNAhybrid、PITA 和RNA22V2 等5 款支持输入序列分析的本地化miRNA 靶标预测工具来进行山羊circ_0008219 序列中miRNA 靶向关系的联合预测，共得到10 个候选miRNA，13 个结合位点信息。验证实验选择了结合类型为8mer 的5 个miRNA，利用双荧光素酶报告系统检测发现miR-130b-5p、miR-423-3p、miR-326-3p 和miR-671-5p 可与载体靶序列结合。本研究表明利用支持序列分析的多工具进行联合预测miRNA 靶位点具有较好的阳性率，为circRNA 与miRNA 靶向关系预测提供了新的思路和方法。