环状RNA 的生物学功能及其对动物肠道屏障功能作用的研究进展

魏文焯，郑 超，刘静波，皮劲松，张 昊*

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064；2.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010）

1976 年，Sanger 等[1]在马铃薯纺锤块茎病的研究中发现类病毒Viroids 可侵染马铃薯植株并导致植株死亡，但与病毒不同的是，其不具备蛋白质外壳，且基因组是单链、闭合的RNA。1979 年，洛克菲勒大学Hsu和Coca-Prados 研究员在电子显微镜下观察到真核细胞细胞质中circ RNA 的存在，随后在小鼠、大鼠及果蝇中陆续发现类似结构的分子[2-4]，但受对ncRNA 的认知水平和技术手段限制，当时仅认为它是RNA 错误剪切的副产物[5]。随着高通量RNA 测序技术、生物信息学技术和基因功能研究的不断发展，人们逐渐发现circ RNA 在机体内发挥着重要作用。2012 年，Salzman 等[6]利用转录组测序技术发现circ RNA 在人类细胞中广泛存在，引发学术界对circ RNA 的研究热度不断提升，目前已经成为分子生物学领域的研究热点。

本文综述了circ RNA 的分类、形成机制、生物学功能及circ RNA 成环的影响因素，并对近几年来在动物肠道屏障功能方面的研究进展进行归纳与总结，以期为动物肠道屏障功能方面的研究提供参考，并对circ RNA 的研究进行展望。

1 circ RNA 的生物学特征

1.1 circ RNA 的结构与分类 circ RNA 是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA 分子[7-8]。在反向剪接过程中，下游5'端剪接位点与上游3' 端剪接位点反向连接，在连接位点形成一个具有3'，5'磷酸二酯键的circ RNA 分子[9-10]。circ RNA 与传统线性RNA 不同，circ RNA 以环状形式存在，其3' 头端和5' 尾端以共价键连接而成，使其避免被RNA 核酸外切酶和脱支酶降解，是其表达稳定，不易降解的重要原因[11-12]。Circ RNA 根据来源可分为三大类[13-15]：①外显子来源的circ RNA（exonic circ RNA，ecirc RNA），ecirc RNA 是由一个或多个外显子首尾拼接而成，其占circ RNA 的绝大多数（超过80%）[16]；②外显子-内含子来源的circ RNA（exon-intron circ RNA，EIcirc RNA），EIcirc RNA 由编码基因的外显子序列和内含子序列组成，不同于仅由外显子序列组成的特异RNA[17]；③内含子来源的circ RNA（circular intronic RNA，ciRNA），ciRNA 广泛存在于细胞核中，由内含子自身环化形成[10]。

1.2 circ RNA 的环化方式 近年来研究表明，circ RNA的环化方式主要有4 种（图1），分别是套索驱动环化、内含子配对驱动环化、RNA 结合蛋白（RBP）驱动环化及ciRNA 的环化[10-11,18]。

图1 circ RNA 形成示意图[22]

套索驱动环化又称为外显子跳跃，即上游5' 剪接供体位点与下游3' 剪接受体位点结合，产生含有内含子和外显子的套索，然后通过反向剪接去除套索中的内含子序列，产生circ RNA，剩余部分形成mRNA。

内含子配对驱动环化又称为直接反向剪接，侧翼内含子的反向互补序列碱基互补配对形成一个环状结构（如Alu 序列），内含子序列随后经前体RNA（premRNA）剪接生成circ RNA。

RNA 结合蛋白（RBP）驱动环化，近年来，有研究发现RBP 如RNA 特异性腺苷脱氨酶1（Adenosine Deaminase Acting on RNA1，ADAR1）和细胞核核糖核蛋白L（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，hnRNP L）与circ RNA 的生成有重要联系，RBP 可通过与侧翼内含子结合使供体位点与受体位点的距离缩短，从而促进外显子的环化[19-20]。

ciRNA 的环化，由靠近5' 端剪切位点的一段长度为7 nt 的含有GU 碱基序列和3' 端分支位点的一段长度为11 nt 的含有C 碱基序列共有基序，以2'，5'-磷酸二酯键使首尾相连形成，ci-ankrd52 是具有代表性的ciRNA[21]。

1.3 circ RNA 的功能

1.3.1 充当miRNA 海绵 miRNA 是一种由内源基因编码的长度在18～25 nt 的非编码RNA，可以通过与mRNA的5'和3'端非编码区（UTRs）结合，使目标mRNA 降解，在动植物中参与转录后基因表达调控作用[23-24]。Circ RNA 可以依靠自身的miRNA 结合位点来吸附特定的miRNA，从而减少miRNA 与靶基因的结合，影响miRNA 对mRNA 的转录后调控[25]。第一个被发现并确认的miRNA 海绵是ciRS-7，它由小脑退化相关蛋白1（CDR1as）产生[26-28]。ciRS-7/CDR1as 包括70 多个miR-7 结合位点，当CDR1as 表达升高时，miR-7 的表达降低，实现miR-7 的有效吸附，削弱miR-7 对靶mRNA的调控作用，致使miR-7的靶基因表达升高[26,29-31]。有研究发现，ciRS-7 上调或miR-7 敲除会损害斑马鱼中脑的发育[29]。同源结构域相互作用蛋白激酶3（Homeodomain-Interacting Protein Kinases-3，HIPK3）基因来源的circ RNA 称之为circ HIPK3，可与miR-124 结合，抑制miR-124 活性[32]。同时，circ HIPK3可吸附miR-558，并通过其靶向mRNA 抑制膀胱癌细胞肝素酶的表达[33]。此外，circ MTO1 能够通过吸附促癌miR-9，促进肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（p21）表达，抑制HCC 增殖，提示circ MTO1 是治疗HCC 的一个潜在靶点[34]。总之，circ RNA 在疾病过程中起重要调控作用，可为疾病的检测及治疗提供新思路。

1.3.2 与蛋白质的相互作用 circ RNA 可与蛋白质相互作用，参与基因的表达调控。正常情况下，细胞周期蛋白依赖性激酶2（Cyclin Dependent Kinase 2，CDK2）与细胞周期蛋白结合推动细胞周期进程，而circ-Foxo3可与CDK2、p21 结合形成circ-Foxo3-p21-CDK2 三元复合物，阻碍CDK2 的功能，从而阻滞了细胞周期运行[35-36]。Abdelmohsen 等[37]研究发现，circ PABPN1可抑制RNA 结合蛋白HUR 与核内poly(A)结合蛋白1（PABPN1）mRNA 的结合，降低PABPN1 mRNA 表达水平。此外，有研究发现盲肌蛋白（Muscleblind，MBL）的表达与circ MBL 有密切联系，当MBL 表达升高，circ MBL 表达增加，若MBL 表达降低，增加的circ MBL 会与MBL 结合下调其表达，控制MBL 表达水平[38]。

1.3.3 参与蛋白质合成 目前有研究表明，若circ RNA 含有内部核糖体进入位点序列（Internal Ribosome Entry Site，IRES）或开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），通过滚动循环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）翻译为有生物活性多肽或蛋白质[39-41]。例如，肌肉组织中的circ-ZNF609 包含一个753nt 的ORF，可以被翻译为肌细胞分化调节蛋白[42]。此外，circ 0041407 结构中包含了IRES，可以翻译为嵌合蛋白[43]。

1.3.4 调控基因的转录 此外，circ RNA 还具有调控基因转录等功能：在人体细胞中，ciRNA（例如ciankrd52）累积在细胞核内，通过与RNA 聚合酶II（Pol II）相互作用，可作为Pol II 转录的正调控因子顺式调控其亲本基因转录[10]。EIcirc RNA 在细胞核内与U1 snRNP 相互作用，并促进亲本基因转录[44]。随着circ RNA 研究的不断深入，更多的生物学功能被逐渐阐释。

2 circ RNA 成环的影响因素

2.1 剪接体成分 剪接体是参与RNA 剪接的大分子复合物，由5 种小的细胞核RNA（small nuclear RNA，snRNA）和170 多个蛋白动态组装而成[45]。剪接体的组成及活性对circ RNA 合成有重要影响，有研究表明，抑制核心剪接体（如SF3b/SF3a 复合体）活性可促进pre-mRNA 反向剪接，剪接体成分缺失可导致circ RNA表达水平上升，但影响的大小主要取决于减少的成分和circ RNA 的种类[46-47]。例如，剪接体中snRNP-U1-70K或snRNP-U1-C 缺失可使PlexA 和pasilla（ps）circ RNA 水平增加10 倍，但对Laccase2、Uex、minibrain（mnb）和CG42663 circ RNA 表达影响较小。

2.2 Pol II 的转录伸长率 Circ RNA 的形成依赖于剪接机制，Pol II 转录伸长率（Pol II Transcription Elongation Rates，Pol II TER）可影响剪接体组装和特异性序列的剪接调控位点。有研究发现，当Pol II 分别携带能减速或加速转录的突变体R749H 或E1126G 转染入细胞时，circ RNA 成环效率与Pol II TER 呈正相关，即Pol II TER 升高时，circ RNA 成环效率较高，反之则低[48]。此外，Liang 等[46]研究发现，抑制Pol II 的转录终止会促进circ RNA 形成，表明Pol II TER 升高会促进circ RNA 合成。

2.3 剪接因子 剪接因子是一种参与RNA 前体剪接过程的蛋白质因子，对circ RNA 形成起重要作用，剪接因子可与侧翼内含子结合，加速circ RNA 反向剪接。有研究表明，可变剪切因子Quaking（QKI）在上皮细胞向间质细胞转化过程中可促进circ RNA 合成[18]。Yu 等[49]研究发现，剪接因子ESRP1 在人类胚胎干细胞中促进circ BIRC6 合成。同时，在乳腺癌中，剪接因子ESRP1促进circ ANKS1B 合成[50]。此外，剪接因子ESRP1 通过与侧翼内含子结合促进circ UHRF1 环化，形成反馈循环，加速口腔鳞状细胞癌发生[51]。可见，剪接因子在circ RNA 形成过程中扮演着重要角色。

2.4 转录速率 有研究发现，在RNA 合成过程中，转录速率会影响RNA 的折叠方式，正常转录过程中，RNA多采用顺序折叠，按照转录顺序进行碱基配对；若转录速率加快，则发生更多非顺序折叠，远端互补序列之间进行的碱基配对增加[52]。而在套索驱动环化过程中，pre-mRNA 在转录过程中发生非顺序折叠，这提示circ RNA 形成可能与转录速度有关。

3 circ RNA 在动物肠道屏障功能作用上的研究进展

随着研究的不断深入，人们揭示了一部分circ RNA 的生物学功能，发现其可能参与人类癌症等疾病的调控过程。与人相比，circ RNA 在动物方面的研究较少，本节对目前动物研究中，与动物肠道屏障相关的circ RNA 研究进展进行总结。

3.1 circ RNA 与肠道机械屏障 circ RNA 参与肠道损伤过程，在肠道疾病发展中起重要作用[53]。近期有研究发现，circ Pan3 可促进肠干细胞自我更新[54]。在克罗恩病中，有学者发现患者结肠黏膜组织中存在着218 个差异表达的circ RNA[55]。Yuan 等[56]在溃疡性结肠炎癌变模型AOM/DSS 小鼠结肠组织中发现有234 个circ RNA 差异表达，提示circ RNA 可能在肠道炎症中发挥重要作用。Wang 等[57]研究表明，circ-SOD2 可能通过与封闭蛋白8（CLDN-8）结合或吸附相关miRNA 的方式影响黏膜屏障功能，介导溃疡性结肠炎发生。Ma等[58]研究发现，ssc-circ-009380 能在传染性肠胃炎病毒（TGEV）感染期间吸附miR-22，激活NF-κB 通路诱导炎症反应。此外，Liu 等[59]在败血症大鼠肠黏膜组织中发现circ-0001105 表达显著下调，而上调circ-0001105 表达后发现，肠黏膜通透性、肠道炎症反应及氧化损伤程度均显著降低。综上所述，circ RNA 可通过miRNA“海绵”作用或与目标蛋白质结合，调控肠道黏膜通透性或介导肠道炎症发生。

3.2 circ RNA 与肠道生物屏障 肠道内微生物菌群构成机体肠道的微生物屏障。正常情况下，肠道微生态处于平衡状态，抵抗病原菌的黏附、定植和入侵，而肠道微生物稳态打破会造成各种疾病发生，影响机体健康。此外，肠道菌群可通过调控circ RNA 表达，来影响机体某些功能。有研究发现，肠道菌群改变可抑制小鼠体内mmu-circ-0000730 表达，提高mmu-miR-466i-3p 及mmu-miR-466f-3p 表 达[60]。Zhang 等[61]研究发现，NLRP3 KO 小鼠肠道中拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度与circ HIPK2 水平呈负相关，而厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度与circ HIPK2 水平呈正相关，进一步试验发现，粪便微生物移植抑制NLRP3 KO 小鼠体内circ HIPK2 表达，从而调节大脑星形胶质细胞功能障碍。此外，机体circ RNA 的表达也可影响肠道菌群的组成。Chen 等[62]研究表明，肠道微生物组成可影响某些circ RNA 在大脑中的表达，反向试验证明，某些circ RNA 在大脑中过表达也可影响肠道菌群组成及其后代遗传，与对照组相比，circ NF1-419 在大脑中过表达会导致SAMP8 小鼠肠道菌群中拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和蓝藻菌门（Cyanobacteria）相对丰度增加，使拟杆菌属（Bacteroides）及乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度发生改变。这些研究强调肠道菌群组成可影响动物机体内某些circ RNA 表达，进而影响机体某些生物学功能。上述研究证明了circ RNA 和肠道微生物之间的关联，同时为以后的相关研究提供参考。

3.3 circ RNA 与肠道免疫化学屏障 肠道免疫屏障由肠黏膜淋巴组织和肠道内浆细胞分泌型抗体（S-IgA）构成，它们通过细胞免疫和体液免疫作用防止致病性抗原对肌体的伤害。circ RNA 与肠道免疫屏障有着紧密联系，Liu 等[59]在败血症大鼠肠道中发现上调circ-0001105的表达可降低肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）和白细胞介素6（IL-6）的生成。固有淋巴细胞3（ILC3）是肠内免疫、炎症和组织稳态的重要调节因子，而circ Kcnt2 表达下调会导致小鼠肠道内ILC3激活和结肠炎的发生[63]。此外，Liu 等[64]在败血症大鼠肠道中发现，沉默circ DNMT3B 可显著提高白细胞介素10（IL-10）和IL-6 的水平，circ DNMT3B 被鉴定为miR-20b-5p 的靶基因，而在加入miR-20b-5p 抑制剂后IL-10、IL-6 的水平显著下调。综上所述，circ RNA 可通过影响肠道免疫因子的水平，进而影响肠道免疫屏障。

4 展 望

目前，人们对circ RNA 的研究还处在初始阶段，在其形成、调控和功能等方面还有许多未解之谜。随着新的研究手段的应用，目前已经证明，生物体细胞中拥有很多不同种类的circ RNA，尽管绝大多数circ RNA的调控机制和功能尚不清楚，但人们已经开始探索它们的功能和作用机制。在动物肠道健康方面，目前有关circ RNA 的研究还比较少，鉴于circ RNA 在调控基因表达及蛋白合成中的重要作用，深入开展有关动物肠道健康相关circ RNA 的筛选与功能研究，可以更好地配合国家无抗养殖策略，提供保护畜禽肠道健康新靶点，同时，也为揭示动物肠道损伤及其发生机制提供新思路。