细胞自噬在雄性繁殖生理中的研究进展

魏冬芹，吴 德，林 燕

（四川农业大学动物营养研究所，四川成都 611130）

细胞自噬（Autophagy）是存在于所有真核生物的基本过程，其主要功能是分解代谢不需要的成分以提供能量和必需的物质。自噬参与雄性生殖系统内多种细胞的生命进程，并涉及雄性生殖系统中许多疾病的关键病理生理过程，如无精子症、少精子症、弱精子症、隐睾症和睾丸炎等[1]。在雄性动物睾丸微环境中，细胞自噬可以保护睾丸细胞的存活或加速部分细胞凋亡[2]。在精子发生过程中，细胞自噬参与了二倍体生殖细胞的诱导，同时参与精子形成过程中精子细胞的分化，以确保形成精子正常的鞭毛和顶体结构[3]。自噬和睾丸激素生物合成之间的联系也直接影响着睾丸的内分泌调节[4]。此外，细胞自噬调控支持细胞外质特化（Ectoplasmic Specialization，ES）的完整性，而ES 是血液-睾屏障（Blood-Testis Barrier，BTB）的基础结构[5]，调控着精子发生。因此细胞自噬在睾丸功能中的参与受到广泛关注，但目前关于自噬在雄性生殖系统中的研究工作并不系统。本文综述了细胞自噬在雄性繁殖生理领域的研究进展，总结了睾丸的生精细胞、间质细胞和支持细胞中自噬引发的调节作用及其分子机制，为研究雄性生殖中细胞自噬提供参考。

1 细胞自噬的简介

细胞自噬是指细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器被运输到溶酶体，溶酶体对其消化降解，以胞质内自噬体的出现为标志的细胞自我消化过程。以双层膜结构包裹部分胞质和细胞器的自噬体为判断指标。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬分为巨自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导自噬（Chaperonemediated autophagy）3 种主要方式，其中巨自噬是主要的自噬形式。本文中除特殊说明外，所讲的自噬均指巨自噬。

自噬体的基本结构首先由Porter 等[6]揭示，其在大鼠肝细胞中观察到自噬体。随后，研究人员在许多其他细胞类型中也观察到自噬体，这表明自噬是真核生物中普遍存在的机制。自噬作用被认为是在营养供给减少和其他外部干扰下细胞平衡代谢稳态的结果。细胞自噬诱导了胞内内源储备的快速动员，以生成三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）作为能量合成的来源[7]。因此，自噬的形成降低了细胞对营养缺乏的敏感性。在肿瘤细胞系中，自噬作为抗逆微环境的普遍现象，比正常细胞更常见。此外，自噬对于正常细胞的存活是必不可少的，并且基础自噬的维持对于生理学上的许多细胞类型的存活和功能至关重要，尤其是神经细胞[8]。自噬的异常与许多疾病有关，如衰老、癌症、心脏病和肥胖[9]。

2 自噬对雄性生殖的生理作用

精子发生是一种高度调节的生物过程，而自噬已被证明是睾丸中精子发生和类固醇产生的重要调节因素。自噬在睾丸不同类型细胞中的不同生理作用见表1。

表1 自噬在睾丸不同类型细胞中的不同生理作用

2.1 自噬在精子发生中的作用 雄性动物睾丸主要由两部分组成，一部分是间质细胞，其主要分泌雄激素，调节精子发生；另一部分是生精小管，是精子产生的主要场所。而生精小管又由支持细胞和各级生殖细胞组成，支持细胞主要发挥对生殖细胞的支持、营养作用，决定生殖细胞数量。

哺乳动物正常的精子发生过程分为3 个不同阶段：有丝分裂期，未分化的精原细胞经历快速增殖；减数分裂阶段，精母细胞通过2 次细胞分裂产生单倍体精子细胞；精子形成期，精子细胞经历形态和功能分化的复杂过程，并导致成熟精子的产生。在此过程中生殖细胞经历了几次结构重组，包括顶体的产生、核染色质的凝聚、线粒体的重排、精子鞭毛的组装以及去除不必要的细胞质到功能性精子的产生[21]。一些研究已经证明了自噬参与了二倍体生殖细胞的诱导，同时参与精子形成过程中精子细胞的分化[10-11]。

2.1.1 二倍体生殖细胞的自噬 哺乳动物睾丸二倍体生殖细胞包括精原细胞和精原干细胞（Spermatogonial Stem Cells，SSCs），其通过重复的有丝分裂和减数分裂形成单倍体精子细胞。在此过程中将经历染色体结构重组和细胞减数分裂过程，确保高分化精子可成功释放到小管腔。但值得注意的是，正常生理条件下SSCs 的自噬水平相对低于睾丸中其他类型的生殖细胞，如在正常生理条件下的圆形和伸长的精子细胞[22]。此外，自噬不参与SSCs 的出生后发育，在精原细胞（7 d）和精母细胞（15 d）阶段没有自噬[22]。在组织学上，SSCs 细胞数量很少，在啮齿动物睾丸中仅占所有生殖细胞的0.03%[23]。在造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）上研究表明，自噬的发生对于HSCs 维持是必不可少的，并且自噬的丧失导致线粒体中活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和DNA 损伤的积累[24]。而与HSCs 类似，SSCs 同样具有相识的特征。精子发生过程中细胞分裂的高速率意味着精原细胞中线粒体氧消耗和ROS 产生的水平相应升高[3]。然而，没有关于自噬在精原细胞中自我调节作用的研究。因此，SSCs 中细胞基础自噬的维持也可能是一种自我保护机制，在其分化和自我更新过程中与HSCs 类似。另一方面，ROS 通过启动不同的下游信号传导途径参与细胞自噬的诱导[10-11]。在小鼠睾丸生殖细胞中已经报道了高浓度的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）在精原细胞的抗氧化防御中起关键作用[10]。在精原细胞中，GSH 消耗导致自噬的诱导。但GSH 的消耗不会影响ROS 水平，其导致S-谷胱甘肽化蛋白质下调，从而导致精原细胞中自噬的诱导，研究表明GSH 耗竭通过独立于腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5'-monophosphate-activated Protein Kinase，AMPK）的信号通路启动自噬[25]。这些证据表明氧化应激可能是通过控制精原细胞中S-谷胱甘肽化蛋白水平来影响精原细胞在生理上转向自噬。由GSH 耗竭诱导的自噬激活不会导致精原细胞中能量状态的改变。

2.1.2 精子细胞分化中的自噬 实际上，与二倍体生殖细胞相比，细长精子细胞中自噬相关蛋白（如LC3 和Atg7）的表达显著更高[13]。通过生殖细胞特异性敲除Atg7 消除自噬后，导致睾丸重量减少，精子畸形，显着降低雄性小鼠的生育能力[26]。精子发生是一种复杂且高度有序的细胞分化过程，需要重组细胞结构和重新调节细胞生理功能。成功去除细胞质被认为对于功能性精子的产生至关重要。精子的功能障碍主要是由精子头部或其鞭毛的异常引起。自噬与精子形成过程密切相关，自噬的缺失将导致精子头部和尾部异常[12]。

在精子中，顶体是位于精子核前部的特殊膜性细胞器，这对于卵丘细胞的分散和受精过程中卵母细胞透明带反应至关重要。顶体的形成涉及细胞骨架的重编程，其需要诱导自噬以辅助细胞骨架的重排。顶体的形成分为高尔基体期、头帽期、顶体期和成熟期4 个阶段[12]。自噬参与从高尔基体阶段开始的顶体形成过程。在高尔基体期，正常条件下高尔基体衍生的前囊泡融合到精子细胞核中，形成靠近细胞核一端的单个顶体囊泡。但在自噬基因Atg7敲除后，高尔基体精子细胞的多个小囊泡不能彼此融合，从而显示出多个顶体囊泡结构。在头帽期，来自高尔基体的多顶体囊泡或聚集体的积累将导致顶体的收缩，致使顶体畸形[13]。这些证据表明，顶体畸形很可能是由于前顶体囊泡未能正常融合而未能被转移到细胞核一端的前体内导致的。从机制上讲，Atg7在顶体生物发生中的功能可能与其在自噬诱导中的作用相关。在自噬发生中，LC3 主要参与自噬囊泡脂质融合。在精子细胞中，LC3 仅与反式高尔基体网络标记（Trans-Golgi Network 38，TGN38）共定位而不是顶体制造者（Sperm Protein 56，SP56）。因此，膜相关LC3 可能参与高尔基体衍生的前囊泡的囊泡融合及其向顶体的转运。在Atg7敲除后，LC3 未能与TGN38 共定位，导致在高尔基体附近的凹陷区域中前囊泡的囊泡积聚[12]。最后，这种积聚损害了后期阶段顶体体积的增加，从而导致顶体形成缺陷。

研究表明，除了自噬对顶体形成的作用外，它还通过线粒体的重排和消除不必要的细胞质参与精子鞭毛的形成，以促进精子的运动。PDZ 和LIM 结构域蛋白1（PDZ and LIM domain protein 1，PDLIM1）是PDZ和LIM 蛋白家族的成员，含有N 末端PDZ 结构域和C末端LIM 结构域。PDLIM1 可以将其他蛋白质带入细胞骨架折叠[3]。在精子发生过程中，PDLIM1 作为自噬和细胞骨架组织之间的介质起作用。在正常条件下，需要通过自噬-溶酶体途径降解PDLIM1 以维持细胞骨架网络的适当动态，从而确保精子细胞分化可以顺利处理。自噬的破坏导致自噬体吞噬PDLIM1 失败，从而导致它们在细胞质中积累。PDLIM1 的积累破坏了细胞骨架的正常动态，并且在精子形成过程中导致细胞质的无效去除，使精子细胞的细胞骨架成分解体[14]，从而导致精子中的鞭毛结构破坏。精子鞭毛结构的正常对于精子的正常运动至关重要，因此自噬能够显著改变精子活动参数，包括平均路径速度（Average Path Velocity，VAP）、直线速度（Straight Line Velocity，VSL）和曲线速度（Curvilinear Velocity，VCL）。

2.2 自噬在睾丸体细胞中的功能 支持细胞和间质细胞是哺乳动物睾丸中存在的2 种体细胞，2 种类型的睾丸体细胞都采用自噬作为维持细胞稳态的调节机制。

2.2.1 自噬在支持细胞中的作用 在精子发生过程中，分化的生殖细胞经历从圆形精子细胞到精子的连续形态转化，这需要精子细胞的细胞重塑和支持细胞的辅助。支持细胞参与曲细精管内许多无用成分的降解，如精子细胞残留体和凋亡生殖细胞。支持细胞具有代谢这些物质的显著能力。自噬与吞噬作用过程有关，并且与支持细胞中进入的外部底物的降解相关。比如将培养的支持细胞暴露于异源的（例如由其他组织产生的外部区段）或同源的底物（例如通过分化生殖细胞产生的残余体），2 种底物类型都被吞噬作用摄取[17]。然而，自噬选择性地参与支持细胞中那些异源的降解，并且抑制自噬显著延缓了异源底物的降解[17]。

支持细胞ES 和精子细胞的顶体复合物是2 种细胞骨架结构，在精子头的成形中起重要作用[5]。其中，ES 由2 个组成部分组成，即血液-睾丸屏障中相邻支持细胞之间基于肌动蛋白的非典型黏附连接，称为基底ES，而支持细胞和生精小管腔表面的精子细胞之间的连接被称为顶端ES。基础ES 功能是成为BTB，顶端ES 与辅助精子细胞头的成形、精子细胞的运动和成熟精子的释放有关[20]。而研究已经证明，自噬基因Atg7或Atg5敲除导致的自噬缺失干扰了生精上皮中顶端ES和基底ES 的组装[1]。机理上的研究表明，与精子细胞顶体形成相似，自噬破坏会损害支持细胞PDLIM1 的降解，从而导致其在支持细胞中的积累[3,18]。因此，支持细胞中细胞骨架的组织受到干扰，ES 结构的破坏最终导致支持细胞-生殖细胞通讯的破坏，从而导致精子头畸形。

ABP 是一种由睾丸支持细胞合成和分泌的蛋白。生精小管中的精子发生过程和附睾中精子的成熟过程都需要高浓度的ABP。在哺乳动物中，ABP 的产生和分泌受促卵泡素、雌二醇和睾酮的调节[1,27]。在支持细胞中，睾酮通过自噬参与ABP 的合成和分泌。体外研究表明ABP 与原代大鼠支持细胞中的LC3 共定位，抑制或刺激自噬显着改变支持细胞中ABP 的表达模式和水平而不影响ABP mRNA 的表达，这意味着自噬对ABP合成分泌具有调节作用[19]。自噬参与的ABP 的降解仅对其蛋白质水平起作用。此外，睾酮对自噬的抑制作用也受睾酮浓度的影响，睾酮浓度增加也进一步抑制自噬的发生[19-20]。

2.2.2 自噬在间质细胞中的作用 前人的研究揭示了自噬在类固醇生成和分泌中的调节作用。在雄性哺乳动物中，睾丸中睾酮占总循环睾酮的95% 左右，而间质细胞是哺乳动物睾丸中的主要睾酮贡献者。与许多其他类型产生类固醇的细胞一样，间质细胞通常比其他细胞类型拥有更大的线粒体。类固醇的生产是直接与线粒体功能的损害有关。在其他细胞类型中已经报道了自噬在细胞线粒体降解中的作用[4]。间质细胞中自噬的频率高于许多其他类型的细胞，如在大鼠间质细胞中也观察到丰富的自噬体吞噬细胞器的现象，封闭在自噬泡中的大多数细胞器是线粒体，即参与雄激素产生的细胞器[28]。这些证据表明自噬活动可能与调节间质细胞中雄激素分泌有关。研究表明，自噬过程与大鼠间质细胞中睾酮产生高度相关，自噬的缺乏通常与睾丸稳态的失调有关[15]。用自噬抑制剂和自噬激活剂分别处理不同日龄大鼠的间质细胞，发现用自噬抑制剂处理的大鼠的间质细胞类固醇生成急性调节蛋白（Steroid Acute Regulatory Protein，StAR）表达和睾酮产生都减少，细胞内ROS水平增加；相比之下用自噬激活剂处理，只增强了来自老年大鼠间质细胞中的类固醇生成，细胞内ROS 水平减少；然而敲除自噬基因Beclin 1的老年大鼠间质细胞中StAR 表达和睾酮产生减少，细胞内ROS 水平增加[16]。这些结果表明自噬缺陷与老年大鼠间质细胞的类固醇生成下降有关，可能受细胞内ROS 水平影响。因此，自噬过程与大鼠间质细胞中睾酮的产生高度相关。

3 自噬调节雄性生殖的重要信号通路

自噬是一种对周围环境极为敏感的生命现象，与能量的调控及营养物质的循环更新密切相关。通过自噬途径对细胞内受损、变性或衰老的大分子物质及细胞器进行降解，降解产生的多种基本营养元素（如氨基酸、核苷酸等）及 ATP 等可参与到细胞的新陈代谢过程中，从而实现营养物质再循环及能量的补充。葡萄糖、氨基酸作为机体的营养素具有密切调控自噬的作用。机体能量参与的调控自噬的最重要信号通路是AMPK-mTORULKl/2，而氨基酸主要通过mTORC1 和GCN2 途径调控自噬。

3.1 AMPK-mTOR-ULKl/2 信号通路 AMPK 是一种在进化过程中高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶[29]。AMPK的活性受体内AMP 水平的影响，AMP 能够与AMPK的γ亚基结合，通过调节 AMPK 构象促进α亚基活性结构域中Thrl72 位点磷酸化，从而激活AMPK。由此，AMPK 被认为是一种“细胞能量感受器”，在调节能量稳态中发挥着重要作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）是细胞代谢的中心调节枢纽，mTOR 可以和不同的蛋白组分形成2 个在结构和功能上均很不同的复合物（mTORC1 和mTORC2）[30]。其中，mTORC1 参与抑制细胞自噬的调节。研究发现，mTORC1 抑制自噬主要通过2 个方面作用：一方面，转录因子能够促进溶酶体生物合成，mTORCl 通过负向调节转录因子抑制溶酶体合成，进而抑制自噬；另外一方面，mTORC1 还能够通过作用于Unc-51-样 激1（UNC-51-like kinase 1，ULKl）和Unc-51-样激酶2（UNC-51-like kinase 2，ULK2）的蛋白复合物抑制自噬作用[31]，其主要参与自噬的启动阶段调节。

AMPK、mTOR、ULKl/2 复合物对自噬的调控机制：在能量充足的条件下，mTORCl 通过磷酸化ULKl/2 的Ser757 位点抑制ULKl/2 激酶复合物功能，从而导致自噬的抑制[32]。当细胞能量不足时，ULKl/2 中mTORCl依赖性的磷酸化位点迅速发生去磷酸化，从而诱导自噬发生。ULKl/2 的mTORCl 依赖性的磷酸化位点去磷酸化通过2 种方式：①自磷酸化并对 Atg13 和FIP200进行磷酸化；②AMPK 磷酸化 ULKl/2 中的Ser317 和Ser777 位点，从而被激活。另外，AMPK 还能够通过磷酸化mTORCl 中的raptor 蛋白从而抑制mTORC1活性，直接导致自噬的发生。同时AMPK、mTOR 以及ULKl/2 复合物在调控自噬的过程中存在负反馈调控机制。一方面，mTORCl 和AMPK 能够通过直接活化ULKl/2 复合物调控其功能从而对自噬产生影响；另一方面，ULKI/2 复合物能够通过磷酸化raptor 调节mTORCl 功能，也能够通过磷酸化AMPK 的3 个亚基调节AMPK 功能[33-34]。

3.2 mTORC1、GCN2/eIF2 信号通路 自噬是细胞中蛋白质降解的重要途径之一，当氨基酸代谢库中氨基酸含量发生变化时，自噬活动会随之受到影响[35]。如仔猪早期断奶后1～2 d，血浆中必需氨基酸浓度降低，机体自噬程度明显升高[36]。可见氨基酸和自噬是相互依赖的。氨基酸主要通过膳食摄入获得，并通过质膜跨膜转运蛋白转运到细胞中。游离的胞内氨基酸不仅作为代谢物和能量的来源，而且直接有助于严格调控2 条途径，即级联整合合成代谢和分解代谢的mTORC1 和真核起始因子2（General Control Non-derepressible 2/eukaryotic Initiation Factor 2，GCN2/eIF2）信号通路[37]。这些通路通过调节蛋白质翻译，并伴随调节自噬依赖性分解代谢来控制细胞对氨基酸的需求。

当细胞中氨基酸充足时，细胞将抑制自噬发生，这主要是mTORC1 通过磷酸化ULKl/2 的Ser757 位点来抑制ULK1/2 激酶复合物诱导的自噬。当氨基酸饥饿时，灭活mTORC1 导致这种含有ULK1 的促自噬性复合物的激活，其促进信号级联以正向调节自噬体的形成，延伸，成熟并最终降解蛋白质。细胞内氨基酸浓度也受另一种丝氨酸/苏氨酸激酶GCN2 调节。被激活的该酶会磷酸化elF2a 的Ser-51 位点，进而降低eIF2 在招募蛋氨酰起始子tRNA 到40S 核糖体亚基方面的功能。由此总的蛋白质翻译受到抑制。研究发现氨基酸缺乏诱导的GCN2/eIF2a 路径激活还可以启动自噬基因转录，从而启动自噬过程而增加胞质中的氨基酸含量[38-39]。GCN2 信号路径激活可以直接启动一些自噬基因转录，如Atgl6、Mapllc3b、Atgl2、Atg93、Becn1 及Gabarapl2，也可以协同CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/ enhancerbinding Protein Homologous Protein，CHOP）完成对一些自噬基因的转录启动，如p62/Sqstml、Nbrl 和Atg97[40]。启动的自噬可以通过循环利用氨基酸来补充细胞内氨基酸的不足。因此，GCN2 激活旨在促进恢复细胞内氨基酸水平。

4 营养通过自噬调节雄性生殖

自噬是一个进化上高度保守的细胞过程，起始于对细胞组分糖原、脂质、可溶性蛋白、核糖体和细胞器的吞噬，随后开始酶解，生成糖、脂质、氨基酸和核苷等基础营养素，接着排出到细胞质中。这些由自噬产生的营养素可以参与到细胞器更新过程中及维持能量水平、蛋白质合成和关键代谢过程中，从而实现营养物质再循环及能量的补充[32,34-35]。所以自噬和营养是密不可分的。Pang 等[41]给羔羊能量限制喂养2 个月，然后再补充喂养3 个月，结果表明，饲喂30% 能量限制饲料的羔羊中的睾丸重量和在生精小管中的精子细胞数量显著降低，但对照组和15%能量限制组之间没有差异。同时，15%和30%能量限制饮食通过激活AMPK-ULK1 信号通路诱导睾丸自噬和凋亡，上调了Beclin-1、LC3-II 和LC3-I 比例，以及激活AMPK，磷酸化AMPK（p-AMPK）和ULK1。此外，当在能量限制后以正常能量需求重新喂养羔羊时，这些参数得到补偿。Zhang 等[42]研究发现，亮氨酸可提高斑马鱼睾丸P62 和LC3-II 的表达，将带荧光标签的LC3 载体转染到HepG2 细胞中发现 LC3 和溶酶体标记物共定位，但亮氨酸的处理抑制了自噬的发生。Zhang 等的研究结果表明，短期用亮氨酸治疗可以通过影响自噬和抑制自噬体和溶酶体的融合来增加斑马鱼的精子活力。

5 结论与展望

现有数据表明自噬与睾丸稳态的调节密切相关，如自噬在调节生殖细胞的存活、精子细胞的转化、支持细胞的重排和间质细胞的睾酮产生中发挥作用。同时营养可以通过AMPK-mTOR-ULKl/2、mTORC1 和GCN2等信号通路调控自噬的发生，但对营养通过自噬发生调节雄性生殖能力的研究较少，但营养介导自噬和自噬相关蛋白在生精细胞中起着促进生殖的作用，并通过直接抑制精原细胞-精母细胞-精子细胞的凋亡来促进ES完整性。因此，通过营养调节自噬的发生将是养殖生产中促进雄性生殖的新方向。