氧化应激对蛋鸡产蛋后期繁殖性能的影响研究进展

李先强，吴 艳，王家乡，程诗彬，皮劲松，张 昊，沈涛涛，黄竹林，王孝忠

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064；2.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434103；3.武汉民族科技饲料有限公司，湖北武汉 430223；4.湖北省宜昌市动物疫病预防控制中心，湖北宜昌 443005）

在蛋鸡养殖过程中，产蛋期分为初产期、高峰期、产蛋后期3 个时期，当产蛋率降至高峰期的80% 时便进入产蛋后期（约400 日龄）[1]，进入产蛋后期蛋鸡的生产性能下降、蛋品质变差[2]。卵巢在衰老过程中表现为卵泡耗竭和卵母细胞质量下降[3]，进而导致卵巢功能持续下降，家禽繁殖力也不断下降。在所有导致卵巢衰老的因素中，由于过度排卵产生的活性氧（ROS）积累引起的氧化应激是最主要的因素之一，氧化应激可引起线粒体损坏、颗粒细胞凋亡、卵泡衰竭、繁殖性能下降，从而导致产蛋量降低。抗氧化防御系统对氧化应激产生调节作用，该系统本身也受氧化应激的影响，如氧化应激对卵母细胞抗氧化能力的调节，故解析产蛋后期氧化应激产生的原因与途径，探明氧化应激与抗氧化能力之间的相互作用，是研究产蛋后期产蛋性能下降的一个重要切入点。本文综述了产蛋后期蛋鸡氧化应激产生的机理及氧化应激对蛋鸡繁殖性能的影响机制，为蛋鸡衰老过程中抵抗氧化应激，缓解蛋鸡卵巢衰退，延长蛋鸡使用年限，提高蛋鸡产蛋量及养殖经济价值提供理论依据。

1 蛋鸡产蛋后期氧化应激产生的原因及机理

1.1 氧化应激产生的过程 ROS 和活性氮（RNS）包括超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢（H2O2）、过氧亚硝酸盐和其他过氧化物、一氧化氮和其他因子。ROS 是通过线粒体内膜在氧化磷酸化和ATP 生成过程中电子泄露形成[4]。氧化应激一般是指内源性或外源性刺激导致机体代谢产生异常而使ROS 和RNS 的量与机体自身的抗氧化防御体系（主要是各种酶类和非酶类的抗氧化剂）之间失衡造成。而氧化平衡是生物体管理生理活动权衡的重要参照点，并通过氧化应激对生殖和衰老的生理活动进行调节[5]。在衰老过程中，由于抗氧化剂水平降低，活性氧生成和清除之间的平衡被打破，从而导致氧化应激[6]。

1.2 蛋鸡卵巢衰老与氧化应激 卵巢作为雌性动物生殖系统中最重要的生殖器官，其衰老现象比任何器官出现的时间都要早[7]，其衰老的标志是卵泡耗竭和卵母细胞质量下降[3]，而在蛋鸡养殖中，卵巢也更易出现衰老迹象，这种卵巢过早衰老的现象可能并不是由于正常衰老所引起。与家养禽类相比，野生鸟类一般性成熟较晚，产蛋数量极少，卵巢机能的衰退速度缓慢[8]，故高产蛋鸡卵巢机能的快速衰退可能与大量排卵有关[9]。有研究认为，年龄相关的功能紊乱是由于生理上的积累对生物分子造成不可修复的损伤，这是正常新陈代谢不可避免的副作用，同时强调防御修复能力的重要性[10]。Tarin等[11]首次提出卵巢老化是由于卵母细胞和颗粒细胞对抗ROS的能力降低，而ROS 积聚是与衰老相关的细胞损伤最重要的生理诱因之一，卵巢长期处于氧化应激的微环境是导致卵巢衰退的主要原因[12]。因过度排卵导致产蛋后期ROS 不断聚集，生理性ROS 水平被认为在卵泡发生、卵母细胞成熟和排卵过程中起到维持正常信号转导途径的作用[13]，但高ROS 水平会导致氧化损伤[14]。有研究表明，氧化应激与颗粒细胞功能障碍和凋亡有关[15-16]；在大鼠体内，氧化应激可诱导颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁[17-18]。与哺乳动物类似，母鸡在衰老过程中由于卵巢氧化应激增加，繁殖力也会严重下降[19]。大量研究结果表明，老龄鸡卵巢组织中ROS 水平过高导致窦状卵泡闭锁、颗粒细胞凋亡和繁殖能力降低[15,20-21]。故产蛋后期生产性能和蛋品质下降的主要原因是长期产蛋积累的氧化应激[22]。

1.3 蛋鸡产蛋后期抗氧化机理 抗氧化剂和氧化剂之间的平衡被认为是反映组织或器官抗氧化能力的一个重要参数，细胞内ROS 水平与内源性抗氧化剂之间的关系对这一指标有重要影响。随着年龄增长，机体酶抗氧化防御能力降低从而导致ROS 产生增加，而非酶活性物质（抗坏血酸、硫醇和生育酚）似乎不会随着年龄增长而减少[23]。参与体内氧化还原稳态的各种酶系统将ROS 维持在较低水平，保护组织免受氧化、亚硝基损伤[24]，在维持内部环境中起到重要作用[25]。

细胞中存在复杂的清除ROS 的抗氧化系统，参与活性氧解毒过程的常见酶有超氧化物歧化酶（SOD）催化从O2-到O2或H2O2的转化；CAT 催 化H2O2分解为H2O 和O2；和过氧化物酶家族成员有助于减少H2O2和脂质过氧化物[5]。另一方面，一氧化氮（NO）被过氧化还原酶（PRDX）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）等酶分解。对于非酶还原能力，谷胱甘肽（GSH）和NAD（P）H 是电子供体，谷胱甘肽可以被氧化形成谷胱甘肽二硫化物（GSSG），GSSG 可以通过谷胱甘肽还原酶利用NAD（P）H 还原回到谷胱甘肽。同时也存在一些其他活性氧传感器，如转录因子核因子Erythroid 2 相关因子2（Nrf2），也是调节细胞氧化还原状态的关键。Nrf2 由阻遏物Kelch 样ECH 相关蛋白1（Keap1）组成型表达，但保持低水平。Keap1 通过泛素-蛋白酶体途径结合并促进Nrf2 降解。在氧化应激下，Keap1 上的半胱氨酸残基被修饰，由此产生的构象变化导致Nrf2 释放。释放的Nrf2 随后被稳定并反式定位到细胞核中，激活抗氧化反应元件（ARE）和许多编码抗氧化蛋白的下游基因，包括硫氧还蛋白（TXN）和谷胱甘肽-二硫还原酶（GSR），其作用是降低细胞ROS水平[26-27]。

在哺乳动物中，衰老导致内源性ROS 水平升高和抗氧化防御能力下降，导致细胞结构中广泛的氧化损伤，包括膜的脂质过氧化、酶失活、蛋白质氧化和DNA 损伤[28]，其中抗氧化酶的下调，特别是线粒体抗氧化酶，会导致ROS 水平升高，导致卵巢氧化损伤[18]。在鸡卵巢老化过程中，细胞内巯基氧化还原稳态和细胞抗氧化防御能力降低，导致卵巢氧化损伤增加，且与年龄相关的氧化损伤可能随着年龄增长而使卵巢功能不断下降[18]。Bodey 等[25]对野生迁徙鸟类氧化状态及其变异后果进行纵向研究，发现鸟类平衡其用于对抗氧化应激的资源，这种个体分配权衡集中于减少ROS 产生的程度，而不是消除或修复所造成的损害。这也解释了因过度排卵导致的氧化失衡所致使的卵泡衰竭，从而使老龄鸡繁殖功能下降。

2 氧化应激对蛋鸡繁殖性能调控机制研究

禽类的氧化应激始于原子水平，化学反应发生于线粒体，线粒体裂解使卵巢颗粒细胞凋亡、抗氧化能力减弱，最终导致卵泡衰竭闭锁，氧化应激通过这一过程实现对老龄鸡繁殖性能的影响（图1）。

图1 氧化应激影响微观至宏观过程[29]

2.1 氧化应激对颗粒细胞及其线粒体的影响 作为卵泡内数量、比重、功能最多的细胞，颗粒细胞在卵泡成长发育过程中发挥重要作用[30]，其中最重要的便是决定卵泡闭锁。而闭锁卵泡数量直接决定蛋鸡产蛋率。卵泡闭锁分为窦闭锁、基底闭锁、终末分化凋亡3 种表型，每种都有不同的启动和调节机制，但都涉及颗粒细胞凋亡[31]。凋亡诱导主要有生存因子、死亡受体和细胞损伤3 个方面。生存因子和促凋亡因子之间的微妙平衡保证卵泡发育和卵巢功能的正常，也影响生殖衰老的程度[3]。而因氧化应激而裂解的线粒体正是打破这种平衡的关键性因素。

线粒体是细胞呼吸的场所，是大多数细胞内源性活性氧产生的主要场所[32]，同时也被认为是组织老化的起搏器，在老龄动物中持续产生氧和氮的自由基，衰老相关的细胞呼吸链电子传递能力降低，电子不断泄露产生过量ROS，造成与线粒体功能相关的氧化损伤[33]，导致卵巢颗粒细胞凋亡、卵母细胞退化，进而引起广泛性的氧化应激，加剧线粒体功能失常[34]、线粒体DNA氧化损伤[35]等现象，最终导致卵子质量下降[36]，影响鸡产蛋后期的繁殖性能，故线粒体功能的维持被认为是延长繁殖寿命的重要因素。其中线粒体动力学蛋白的改变是导致凋亡的重要原因[37]，氧化应激导致线粒体膜裂变，产生大量裂解的线粒体，释放Cyt-C 和其他凋亡因子[38-39]，激活p53 特异性信号通路，触发凋亡机制[40]，激活半胱天冬酶级联蛋白，形成Cyt-C/Apaf1/caspase-9凋亡小体导致Caspase-3 裂解，最终使细胞凋亡[41]。除衰老因素外，有研究表明，其他因素引起的氧化应激也能促使线粒体裂解，热暴露诱导的氧化应激与鸡线粒体复合体的活性被抑制与有关[42]，NH3的吸入也会导致肉仔鸡线粒体膜消失，氧化应激增加，并导致线粒体动态蛋白失衡[43]。

在蛋鸡衰老的过程中，颗粒细胞的抗氧化能力也会减弱，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、泛醇和细胞色素C（Cyt-C）氧化还原酶、琥珀酸脱氢酶（SDH）水平下降导致清除自由基的能力降低，导致线粒体中ROS 大量积聚，从而加速颗粒细胞凋亡进程[32,44-45]。生殖衰老与Cu/ZnSOD、MnSOD 和过氧化氢酶（CAT）基因的下调有关，主要涉及线粒体的氧化损伤累积[46]。在颗粒细胞中，抗氧化酶在清除类固醇激素合成过程中产生的超氧阴离子和过氧化氢方面起着至关重要的作用，可能是导致ROS 水平升高的原因。

2.2 氧化应激对卵母细胞抗氧化能力的影响 氧化应激对繁殖性能的影响不仅对卵母细胞有直接作用，随着机体衰老，卵母细胞抗氧化能力下降，清除ROS 能力减弱，积聚的ROS 将会对抗氧化系统造成进一步破坏，加剧氧化损伤。在人卵巢中，SODs、CAT 和GSSPx 的活性确保了对ROS 的有效清除作用，从而阻止它们迅速扩散到卵母细胞中，SOD 和CAT 活性的年龄依赖性变化导致CAT/SOD 比率降低，GSSPx/SOD 比率略有下降，活性氧清除效率降低[47]。而在老年小鼠的排卵成熟卵母细胞中，GSH 和GST 水平降低，推测可能与SOD活性有关[48]。Lim 等[18]也验证了小鼠卵巢抗氧化防御能力随年龄增长而降低，氧化损伤增加的假说。除此以外，有研究发现来自老年小鼠的卵母细胞中，一些抗氧化基因的表达降低，包括Sod1、Glrx1、Gclm、Gsr、GLRX 相关蛋白和Txn1[49-50]。在禽类中，Liu 等[22]研究发现，在蛋鸡的自然衰老过程中，Nrf2/HO-1 途径被下调。番茄红素通过激活Nrf2/HO-1 途径来减轻D-Gal诱导的衰老和自然衰老卵巢中的氧化应激。GUO[51]研究表明，日粮中添加丙二醛（MDA）可以提高血清总超氧化歧物酶（T-SOD）活性、肝脏和空肠CAT 活性，提高蛋鸡的抗氧化能力，有助于提高蛋鸡的生产性能。综上可知，SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶活性是消除活性自由基的保护性反应的重要因素[52]。在产蛋后期鸡卵巢中，若其活性降低，过量的自由基会影响功能蛋白、不饱和脂肪酸和核酸，从而对机体功能造成氧化损伤，导致生殖性能下降[22]。

2.3 促性腺激素对氧化应激的影响 卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）的分泌由下丘脑衍生的促性腺激素释放激素（GnRH）刺激，通过下丘脑-垂体-卵巢轴（HPG 轴）的反馈回路提供控制卵泡选择和优势的主要机制[40]。促性腺激素在促进卵泡发育、闭锁、排除的过程中起到重要作用，在哺乳动物中，雌激素（E2）和FSH 可作用于下丘脑和垂体，并调节卵巢卵泡和卵子的生成[53-54]，卵巢老化的过程伴随着雌激素的显著减少。研究表明在小鼠体内E2能激活抗氧化酶SOD、CAT 和GPx 的表达[55]。E2在SOD、CAT、GPx 等 抗氧化剂mRNA 表达中起着积极的作用。雌激素缺乏会降低SOD，增加超氧阴离子自由基，并导致抗氧化酶调节活性氧的生成[56]。有研究发现，促性腺激素可能不是产蛋后期家禽卵巢机能衰退的主要因素[57]。产蛋量的正常下降与母鸡黄体生成素高峰之间的间隔变化无关[58]。然而Niranjan 等[59]研究认为E2在氧化应激过程中起重要作用，E2分泌减少，缓解卵巢氧化应激的作用也会降低[60]，而三苯氧胺作为一种抗氧化剂，通过降低雌激素受体α降低氧化应激。综上所述，在蛋鸡衰老过程中，促性腺激素可能在排卵过程中有阶段性分泌高峰，但其是否影响卵巢衰退仍需进一步研究。

3 结 语

产蛋后期蛋鸡产蛋率下降主要是卵巢衰老造成，而鸡卵巢衰老的标志是卵巢卵泡数量减少和卵子质量下降，其主要原因是过度排卵引起产蛋后期细胞内大量ROS 的积聚引起的氧化应激。蛋鸡在产蛋后期，卵巢组织中ROS 积聚，卵巢组织抗氧化能力降低、颗粒细胞凋亡、线粒体损伤、氧化应激加剧从而导致产蛋量下降，缩短了种鸡的使用年限，影响养殖收益。