猪卵母细胞冷冻技术研究进展

吴佳宁

摘要：综述了猪卵母细胞的冷冻保存方法和解冻方法，同时对影响冷冻的因素、保护剂的选择等方面进行了探讨并对猪卵母细胞冷冻技术进行了展望。

关键词：卵母细胞；冷冻保存；猪

中图分类号：S814.6文献标识码：B文章编号：1007-273X（2014）05-0071-02

近年来，随着动物胚胎生物技术的迅速发展，对卵母细胞的需求日益增加，仅通过回收体内成熟卵母细胞已经无法满足科研和生产的需要。而从屠宰场回收废弃卵巢加以利用以获取大量卵母细胞，可望成为一条有效的途径。猪卵母细胞冷冻保存有助于优良地方猪种种质资源的保护，有助于资源共享与交换。动物卵母细胞是母系遗传信息的载体，通过冷冻保存动物的卵母细胞，不但可以建立雌性动物的基因库，还可充分利用卵母细胞资源，使体外受精、转基因和核移植技术研究不受时间和地域的限制。另一方面，通过体外受精实现胚胎的体外生产，也可为胚胎生物技术提供丰富的材料来源；通过“试管动物”的生产，为克服珍稀濒危动物的生殖疾病提供良好的解决方案。猪卵母细胞冷冻的研究还可为丰富低温生物学的理论、方法和实践提供重要的依据。

1猪卵母细胞的冷冻保存方法

1.1玻璃化冷冻

玻璃化冷冻是把卵母细胞置于高浓度冷冻保护液中，经过短时间平衡（1～2 min） 或不平衡，直接投入液氮保存。它是超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，一般是将经过不同防冻剂浓度平衡的卵母细胞由0 ℃以上温度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷冻多采用两步法，即先用低浓度的冷冻保护剂预平衡3～5 min，再放入终浓度冷冻液，立即装管，经液氮熏蒸1～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。该法的特点是细胞在室温脱水后不需要降温程序，简便易行，该过程中水分在细胞内外都要结晶。

1.2程序化冷冻

卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理后，以1 ℃/ min 速度降温，在-5～-7 ℃诱发结晶，然后以0.3～0.8 ℃/ min的速度降温至-30～-40 ℃，投入液氮中保存。该法是程序化冷冻的基础程序。将GV期或MII期卵母细胞在TCM199中洗2～3次，转移到冷冻保护剂中，进行逐步浓度梯度平衡。首先，将卵母细胞转移到3%EG中平衡5 min，再转移到6%EG中平衡5 min，最后转移到9%EG中平衡5 min，并装入0.25 mL的塑料麦管，每管含卵母细胞约15枚。

装管顺序和各部分的量分别为：冷冻液（4 cm）→空气（0.5 cm）→含卵母细胞冷冻液（2 cm）→空气

摘要：综述了猪卵母细胞的冷冻保存方法和解冻方法，同时对影响冷冻的因素、保护剂的选择等方面进行了探讨并对猪卵母细胞冷冻技术进行了展望。

关键词：卵母细胞；冷冻保存；猪

中图分类号：S814.6文献标识码：B文章编号：1007-273X（2014）05-0071-02

近年来，随着动物胚胎生物技术的迅速发展，对卵母细胞的需求日益增加，仅通过回收体内成熟卵母细胞已经无法满足科研和生产的需要。而从屠宰场回收废弃卵巢加以利用以获取大量卵母细胞，可望成为一条有效的途径。猪卵母细胞冷冻保存有助于优良地方猪种种质资源的保护，有助于资源共享与交换。动物卵母细胞是母系遗传信息的载体，通过冷冻保存动物的卵母细胞，不但可以建立雌性动物的基因库，还可充分利用卵母细胞资源，使体外受精、转基因和核移植技术研究不受时间和地域的限制。另一方面，通过体外受精实现胚胎的体外生产，也可为胚胎生物技术提供丰富的材料来源；通过“试管动物”的生产，为克服珍稀濒危动物的生殖疾病提供良好的解决方案。猪卵母细胞冷冻的研究还可为丰富低温生物学的理论、方法和实践提供重要的依据。

1猪卵母细胞的冷冻保存方法

1.1玻璃化冷冻

玻璃化冷冻是把卵母细胞置于高浓度冷冻保护液中，经过短时间平衡（1～2 min） 或不平衡，直接投入液氮保存。它是超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，一般是将经过不同防冻剂浓度平衡的卵母细胞由0 ℃以上温度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷冻多采用两步法，即先用低浓度的冷冻保护剂预平衡3～5 min，再放入终浓度冷冻液，立即装管，经液氮熏蒸1～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。该法的特点是细胞在室温脱水后不需要降温程序，简便易行，该过程中水分在细胞内外都要结晶。

1.2程序化冷冻

卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理后，以1 ℃/ min 速度降温，在-5～-7 ℃诱发结晶，然后以0.3～0.8 ℃/ min的速度降温至-30～-40 ℃，投入液氮中保存。该法是程序化冷冻的基础程序。将GV期或MII期卵母细胞在TCM199中洗2～3次，转移到冷冻保护剂中，进行逐步浓度梯度平衡。首先，将卵母细胞转移到3%EG中平衡5 min，再转移到6%EG中平衡5 min，最后转移到9%EG中平衡5 min，并装入0.25 mL的塑料麦管，每管含卵母细胞约15枚。

装管顺序和各部分的量分别为：冷冻液（4 cm）→空气（0.5 cm）→含卵母细胞冷冻液（2 cm）→空气

摘要：综述了猪卵母细胞的冷冻保存方法和解冻方法，同时对影响冷冻的因素、保护剂的选择等方面进行了探讨并对猪卵母细胞冷冻技术进行了展望。

关键词：卵母细胞；冷冻保存；猪

中图分类号：S814.6文献标识码：B文章编号：1007-273X（2014）05-0071-02

近年来，随着动物胚胎生物技术的迅速发展，对卵母细胞的需求日益增加，仅通过回收体内成熟卵母细胞已经无法满足科研和生产的需要。而从屠宰场回收废弃卵巢加以利用以获取大量卵母细胞，可望成为一条有效的途径。猪卵母细胞冷冻保存有助于优良地方猪种种质资源的保护，有助于资源共享与交换。动物卵母细胞是母系遗传信息的载体，通过冷冻保存动物的卵母细胞，不但可以建立雌性动物的基因库，还可充分利用卵母细胞资源，使体外受精、转基因和核移植技术研究不受时间和地域的限制。另一方面，通过体外受精实现胚胎的体外生产，也可为胚胎生物技术提供丰富的材料来源；通过“试管动物”的生产，为克服珍稀濒危动物的生殖疾病提供良好的解决方案。猪卵母细胞冷冻的研究还可为丰富低温生物学的理论、方法和实践提供重要的依据。

1猪卵母细胞的冷冻保存方法

1.1玻璃化冷冻

玻璃化冷冻是把卵母细胞置于高浓度冷冻保护液中，经过短时间平衡（1～2 min） 或不平衡，直接投入液氮保存。它是超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，一般是将经过不同防冻剂浓度平衡的卵母细胞由0 ℃以上温度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷冻多采用两步法，即先用低浓度的冷冻保护剂预平衡3～5 min，再放入终浓度冷冻液，立即装管，经液氮熏蒸1～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。该法的特点是细胞在室温脱水后不需要降温程序，简便易行，该过程中水分在细胞内外都要结晶。

1.2程序化冷冻

卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理后，以1 ℃/ min 速度降温，在-5～-7 ℃诱发结晶，然后以0.3～0.8 ℃/ min的速度降温至-30～-40 ℃，投入液氮中保存。该法是程序化冷冻的基础程序。将GV期或MII期卵母细胞在TCM199中洗2～3次，转移到冷冻保护剂中，进行逐步浓度梯度平衡。首先，将卵母细胞转移到3%EG中平衡5 min，再转移到6%EG中平衡5 min，最后转移到9%EG中平衡5 min，并装入0.25 mL的塑料麦管，每管含卵母细胞约15枚。

装管顺序和各部分的量分别为：冷冻液（4 cm）→空气（0.5 cm）→含卵母细胞冷冻液（2 cm）→空气