PACAP-38含量在老年无先兆偏头痛不同阶段的变化及对头痛严重程度的影响

任占秀 宋月婷 何 秋

现有研究发现偏头痛发生与遗传、内分泌、精神及饮食等因素有关。老年人由于多种疾病并存，需要服用多种药物，更容易受到药物副作用的影响而引发头痛，甚至药物过度使用也可能引起头痛，使得偏头痛的诊断和鉴别变得更加困难，药物相互作用也使得治疗复杂化。

近年来感觉性神经肽类物质的释放对偏头痛发作的影响越来越受到重视，垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP)是一种神经肽，参与调节痛觉等多种功能[1]。以往的研究已经证明，偏头痛发作期外周血中PACAP-38含量升高，从而参与三叉神经系统的激活，引起头痛发生[2]。但是目前PACAP-38含量在偏头痛的哪个时期升高，头痛发作时含量变化的程度和头痛程度的关系国内外还未见相关研究。本文对无先兆偏头痛不同阶段老年患者外周血中PACAP-38含量进行比较，并分析PACAP-38含量变化与头痛严重程度之间的相关性，为老年患者偏头痛的用药以及用药时机提供新的依据。

1.资料与方法

1.1 一般资料 筛选85例2017年9月到2019年12月于我院就诊的诊断为无先兆偏头痛老年患者，所有患者在研究之前均已签署知情同意书。本研究已经过我院伦理委员会审核和批准。

1.2 入组标准

1.2.1 无先兆偏头痛的诊断标准：所有入组者均同时由两名神经内科主治医师职称以上医生根据2018年国际头痛疾病分类第3版(International Classification of Headache Disorders，ICHD-3)无先兆偏头痛诊断标准进行独立诊断[3]。无先兆偏头痛的诊断标准如下：(1)符合下列(2)～(4)特点的头痛发作次数≥5次。(2)每次头痛发作持续4～72h(未经治疗或者治疗无效的)。(3)每次头痛发作时有至少下列2项症状：①单侧；②搏动性；③中重度头痛；④日常活动可引起头痛加重或因头痛而避免日常活动。(4)头痛发作过程中，有至少下列1项伴随症状：①恶心和(或)呕吐；②畏光和畏声。(5)不能用ICHD-3中的其他诊断更好地解释。

1.2.2 前驱期标准：(1)既往曾有以下至少一种症状后72h内出现头痛发作。(2)常见症状：①疲惫乏力感；②颈部僵硬；③焦虑易怒不适；④畏声畏光；⑤频繁打呵欠；⑥注意力不集中；⑦恶心呕吐；⑧其他[4]。

1.2.3 入组标准：①符合无先兆偏头痛诊断标准。②偏头痛发作存在前驱期。③年龄≥65岁。

1.2.4 排除标准：①年龄<65岁。②有明确病因的继发性头痛者。③合并其他类型原发头痛者。④严重血液系统或凝血功能异常者。⑤重度焦虑抑郁或神经分裂等精神科疾病。⑥哺乳期妇女、孕妇。⑦3月内曾参加其他临床试验。⑧不能配合及时采血者。

1.3 研究对象分组 将85例入组老年患者根据偏头痛发病所处的不同阶段分为前驱期(n=85)、发作期(n=85)和发作间期(n=85)。本研究对同一患者不同阶段外周血中PACAP-38的含量进行自身对照。

1.4 研究方法

1.4.1 基本资料收集：收集所有研究对象的人口学信息，记录偏头痛患者的详细病史。人口学信息包括患者的姓名、年龄、性别、职业、联系方式等情况。头痛的病史包括：病程、发作的频率、部位、头痛程度(以视觉模拟评分VAS评价)、伴随症状、诱发缓解因素、每次头痛持续时间、前驱期症状表现及持续时间、用药情况等信息。既往史主要明确有无类似遗传史和特殊颅内疾病史。所有患者近3月内主要辅助检查化验未见明显异常，包括心电图、头CT或头MRI和头MRA，以及血常规、肝肾功、血糖等。

1.4.2 实验设备和试剂：①EDTA采血管(BD公司)。②eppendorf管、吸头(爱思进生物技术有限公司)。③微量移液器(德国艾本德公司)。④酶标仪(瑞士帝肯公司)。⑤数显电热恒温水浴箱(日本三洋公司)。⑥海尔超低温冰箱(海尔公司)。⑦离心机(上海安亭科学仪器有限公司)。⑧人PACAP-38酶联免疫检测试剂盒(上海酶研生物科技有限公司)。

1.5 检测方法

1.5.1 研究对象血液采集：所有入组的无先兆偏头痛患者在偏头痛前驱期立即采血(只有在定义前驱期症状后72h内出现典型偏头痛发作，本次血样才采用，否则在下一个典型前驱期再次采血)，头痛发作期立即采血，发作间期在晨起空腹状态下采血。每次采取肘部静脉血2ml，置于EDTA采血管中。采血后2h内于4℃离心机上4000r/min离心10min，然后取上清液分装，做好标记并保存于-80℃冰箱，检测前避免反复冻融。

1.5.2 血浆中PACAP-38含量检测(ELISA法)：严格按照试剂盒说明书操作，步骤简述如下：①常温下平衡血样和试剂盒30min。②样本稀释液倍比稀释标准品，稀释后浓度分别为：0.5ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，4ng/ml，8ng/ml。③蒸馏水稀释浓缩的洗涤缓冲液20倍。④设空白对照孔1个，标准孔5个。空白孔内加入标准品稀释液50μl，标准孔内依次加入之前稀释好的不同浓度的标准品50μl。样品孔内加入血样离心上清10μl和样本稀释液40μl(相当于稀释样本5倍)。⑤空白孔外的所有孔内均快速加入酶标记的抗体100μl，用封板膜封住所有孔，置于提前预热好的37℃恒温水箱温育60min。⑥去掉封板膜，用洗涤液重复洗板5次。⑦各孔中分别先后加入底物A和B各50μl，置于提前预温好的37℃恒温水箱中，避光温育15min。⑧各孔加入终止液50μl，在酶标仪上测定各孔的OD值(450nm波长处)。横坐标为标准品不同浓度，纵坐标为不同浓度对应测量的OD值，绘制标准曲线，再根据每个样本孔OD值计算出各样本浓度值，最终结果需乘以5得到实际样本浓度。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。对资料进行正态性检验，对满足正态分布的计量资料采用(均数±标准差)方式表示，采用两独立样本的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。在发作期和发作间期外周血中PACAP-38含量差值作为PACAP-38变化程度，偏头痛患者头痛发作时外周血中PACAP-38含量变化程度与头痛严重程度之间的相关性采用Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 一般资料统计

2.1.1 入组患者的人口学资料和临床病史资料统计：根据入组和排除标准，共有85例无先兆偏头痛患者进入本研究，其中女性45例，男性40例，女性所占比例为52.94%；平均年龄为(70.88±4.69)岁。对85例无先兆偏头痛患者的临床病史资料进行统计：头痛平均病程为(14.67±7.78)年，头痛发作时平均疼痛程度(VAS评分)为(6.9±1.77)分，平均每个月发作频率为(6.67±4.81)d。

2.1.2 入组患者的前驱期发病情况资料统计：前驱期主要症状：疲惫乏力感53例，颈部僵硬38例，焦虑易怒不适30例，畏声畏光22例，频繁打呵欠32例，注意力不集中27例，恶心呕吐26例，其他2例(1例腹胀频繁打嗝，1例腹痛有排便感)。只有1种前驱期症状的有9例，占10.59%；2～3种前驱期症状的有54例，占63.53%；4种以上前驱期症状的有22例，占25.88%。前驱期持续时间：0～12h有27例，占31.8%；12～24h有31例，占36.5%；24～48h有20例，占23.5%；48～72h有7例，占8.2%。

2.2 各组外周血中PACAP-38含量比较 对无先兆偏头痛前驱期组和发作间期组外周血中PACAP-38含量进行比较，结果显示前驱期组外周血中PACAP-38含量(102.98±18.16)pg/ml明显高于发作间期组(89.36±18.52)pg/ml，P<0.001，差异有显著性意义。对无先兆偏头痛发作期组和前驱期组外周血中PACAP-38含量进行比较，结果显示发作期组外周血中PACAP-38含量(115.19±11.86)pg/ml明显高于前驱期组(102.98±18.16)pg/ml，P<0.001，差异有显著性意义，见图1。

注：外周血中PACAP-38含量在前驱期组明显高于发作间期组(*P<0.001)；外周血中PACAP-38含量在发作期组明显高于前驱期组(**P<0.001)。图1 偏头痛发病所处的不同阶段外周血中PACAP-38含量比较

2.3 无先兆偏头痛患者头痛发作时外周血中PACAP-38含量变化与头痛严重程度之间的相关性 分析无先兆偏头痛患者头痛发作时外周血中PACAP-38含量变化程度与头痛程度之间的相关性，外周血中PACAP-38在发作期和发作间期含量差值作为PACAP-38变化程度，统计分析表明PACAP-38含量变化程度与头痛严重程度之间无显著相关性，见图2。

注：二者之间无明显相关性(r2=0.01，P>0.05)。图2 对无先兆偏头痛患者发作期外周血中PACAP-38含量变化程度与头痛严重程度的相关性分析

3.讨论

偏头痛是包括老年人在内的所有年龄组中最常见的神经系统疾病之一，与年轻患者组相比，老年患者组偏头痛的临床表型似乎也有所不同，老年偏头痛更常见于双侧。此外，偏头痛与血管损伤以及其他多种共病、多种药物以及药效学和药代动力学的年龄相关变化的鉴别困难，使得对这一人群的治疗具有挑战性，特别是考虑到世界范围内预期寿命的增加，偏头痛仍然是主要的个人和公共健康问题[5]。与非头痛患者相比，偏头痛患者具有更严重的负担或日常生活影响，偏头痛发作的严重性与偏头痛发作频率密切相关[6]。因此，成功控制偏头痛发作不仅缓解了患者的症状，改善了与健康有关的生活质量，而且减少了对医疗资源的需求。

偏头痛的发病机制目前尚不清楚，目前多认为，偏头痛患者由于多个易感基因之间、易感基因与环境因素之间的复杂相互作用而导致中枢神经系统兴奋/抑制平衡功能失调。近年来三叉神经血管学说在偏头痛的病理生理机制中占据越来越重要的主导地位。这一理论认为当三叉神经系统激活时，三叉神经触发颅内各种血管活性神经肽(如CGRP、神经激肽A和P物质等)的释放，通过一系列复杂的信号传导机制诱发偏头痛发作[7]。临床上已经证明偏头痛患者发作期血浆中血管活性神经肽PACA-38水平高于发作间期[8]。同时也有多项临床研究证明静脉输入PACAP-38可诱发偏头痛样头痛发作[9,10]。因为PACAP-38对PAC1受体有更高的亲和力，所以PAC1受体可能是未来抗偏头痛的药物靶点[11]。现有的研究证明外源性PACAP-38诱导偏头痛发作并非立即出现的，而是延迟发生的，同时证实静脉输注PACAP-38确实会诱发一部分偏头痛患者出现前驱期症状[12]。因此推测在偏头痛患者中，血浆中PACAP-38含量的变化先于头痛发作而在前驱期就开始升高，这在本实验中得到证实，偏头痛老年患者前驱期PACAP38水平即开始升高，在头痛发作期达到高峰。

偏头痛患者前驱期是指在头痛发作前72h内出现的非头痛症状，主要包括疲惫乏力、嗜睡、打哈欠、恶心呕吐、畏声、畏光等，注意力涣散、颈部僵硬等同样不少见。偏头痛患者前驱期的自主神经症状被认为与多巴胺及下丘脑有关。还有研究认为与脊髓三叉神经核活性改变有关[13,14]。前驱期发病机制还可能与下丘脑后外侧区、中脑被盖区和黑质、导水管周围灰质、背侧脑桥和包括枕叶、颞叶和前额叶皮质在内的各种皮质区的激活有关[15]。

在以往头痛急性期管理中，大多数研究建议在偏头痛头痛发作初始时给予急性期药物治疗。为了更快起到止痛目的，甚至研究开发出了速效剂型，如鼻喷剂、皮下剂型、速溶剂、泡腾片，甚至静脉用药途径等[16]。实际上在目前对偏头痛的生理机制理解中，前驱期完全可以很好地预测偏头痛的开始，完全可以在前驱期给予药物干预。目前已经有研究证实在前驱期给予急性期药物能在一定程度上避免头痛发作或者即使出现头痛，头痛的程度也有降低[17]。比如有研究在偏头痛前驱期给药，纳曲普坦和多潘立酮就是有效的[18]，这样比在头痛发作时用药能够更好地减轻偏头痛带来的日常生活影响和社会经济负担。

研究证实在前驱期即有PACAP-38水平的变化，因为PACAP-38的变化预示着更多神经生理机制的发生，本研究直接意义似乎是在PACAP-38治疗靶点的用药时机上可选择在前驱期就开始用药，也就是头痛预警期开始服药，以达到最大程度上终止头痛发作或者减轻发作程度的目的，从而降低偏头痛频繁严重发作对日常生活和工作的影响。

本研究表明老年患者偏头痛发作期PACAP-38水平的增加和头痛的程度关系不大，这提示头痛程度可能是多种复杂因素相互作用的结果，仅仅PACAP-38水平的增高不足以影响头痛发作时的强度。这也反映偏头痛在发病机制以及治疗上的复杂性。

本研究的不足之处：并未纳入有先兆偏头痛的数据，同时需要更多的临床数据支持本研究的结论。期望在不久的将来，有急性期药物在前驱期用药的直接证据和更多获益的证据出现，同时期望能找到影响头痛程度更多相关的因素。