油茶籽粕多糖羧甲基化、乙酰化修饰及其对透明质酸酶的抑制作用

杨建安 张 超 文焱炳 方 芳

(1.贵州省化工研究院，贵州 贵阳 550002；2.长沙理工大学化学与食品工程学院，湖南 长沙 410114)

多糖是一类由不少于10个单糖分子通过糖苷键结合而成的多羟基醛或者酮的高分子聚合物[1]。研究表明，天然植物多糖具有抗肿瘤[2]、降血糖[3]、降血脂[4]、抗氧化[5]、抗癌[6]、抗辐射、抗衰老、保肝、抗菌[7]等多方面的生物活性作用。油茶籽粕是油茶籽经机械榨油后的副产物，其中含有多糖、残油、茶皂素、蛋白质等物质[8]。

油茶籽粕中含有20%～40%的油茶籽粕多糖(CamelliaOleiferaseed meal Polysaccharides，COP)[9]，但目前其利用率较低。研究[10-11]发现，大部分天然植物多糖都具有活性或只具有较弱的活性，其大多受多糖分子中化学结构的影响，所以通过改变天然植物多糖的大分子结构、分子质量、取代基团种类、作用点位置和数量等就可以改变其理化性质和生物活性，从而扩大植物多糖的应用范围和利用率。多糖的羧甲基化及乙酰化修饰产物可能对透明质酸酶的抑制活性产生积极影响[12-13]，但目前有关COP羧甲基化、乙酰化修饰及其修饰产物对透明质酸酶的抑制活性影响尚未见报道。文章拟通过单因素试验，研究各因素对COP羧甲基化及乙酰化修饰的影响规律，并探索不同取代度修饰产物对透明质酸酶抑制活性的影响，以期为COP更好的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶籽粕饼：市售；

氯乙酸、乙酸酐、羟基乙酸、盐酸羟胺、三氯化铁、2，7-二羟基萘、邻苯三酚、水杨酸钠、α-五乙酰基葡萄糖、透明质酸酶等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

恒温磁力搅拌器：85-2型，常州亿通分析仪器制造有限公司；

旋转蒸发仪：RE-201D型，巩义市予华仪器有限责任公司；

减压抽滤装置(循环水式真空泵)：SHZ-D(Ⅲ)型，巩义市予华仪器有限责任公司；

真空干燥箱：DZF-6010型，巩义市予华仪器有限责任公司；

紫外分光光度计：723型，天津冠泽科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶籽粕多糖的制备 油茶籽粕经干燥、粉碎、石油醚脱脂，在料液比1∶8(g/mL)、时间2 h、温度70 ℃下，采用95%乙醇对茶皂素进行脱除，离心收集沉淀。将脱除茶皂素的粉末按固液比1∶10(g/mL)加入蒸馏水，75 ℃下搅拌浸提3 h，离心后取上层清液，多次浸提合并上清液，即获得COP水提液，将上清液旋蒸浓缩至原体积的1/4，用Sevage法除去蛋白，加入其4倍体积浓度为95%的乙醇，4 ℃醇沉24 h，离心，取上清液，沉淀冷冻干燥得COP。

1.3.2 羧甲基化修饰COP工艺研究 采用氢氧化钠—氯乙酸法[14]。取240 mg COP，在NaOH浓度1.5 mol/L，反应时间3 h，反应温度60 ℃下进行羧甲基化修饰。采用控制变量法，选择NaOH浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mol/L，反应时间分别为1，2，3，4，5 h，反应温度分别为40，50，60，70，80 ℃，以羧甲基取代度为指标，考察各单因素对羧甲基取代度的影响，确定羧甲基化修饰COP的最佳工艺。

1.3.3 乙酰化修饰COP工艺研究 采用乙酸酐法[15]。取100 mg COP，在乙酸酐用量3.0 mL，反应时间3 h，反应温度60 ℃下进行乙酰化修饰。采用控制变量法，选择乙酸酐用量分别为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，反应时间分别为1，2，3，4，5 h，反应温度分别为30，40，50，60，70 ℃，以乙酰基取代度为指标，考察各单因素对乙酰基取代度的影响，确定乙酰化修饰COP的最佳工艺。

1.3.4 取代度的测定

(1)羧甲基取代度：采用分光光度法[12]。按式(1)计算羧甲基取代度。

(1)

式中：

DS1——羧甲基取代度；

A——多糖中羟基乙酸百分含量，%。

(2)乙酰基取代度：采用羟胺比色法[16]。按式(2)计算乙酰基取代度。

(2)

式中：

DS2——乙酰基取代度；

M——多糖中乙酰基百分含量，%。

1.3.5 COP、CM-COP和Ac-COP的红外光谱表征 取COP、CM-COP和Ac-COP干燥后样品各6 mg，分别与100 mg已烘干的KBr混合，研磨，压片，使用红外光谱仪于4 000～400 cm-1进行扫描[17]。

1.3.6 溶解度分析 称取一定量的COP、CM-COP及Ac-COP，加入20 mL蒸馏水，震荡至充分均匀，观察其在冷水、加热或超声辅助条件下的溶解情况，并采用紫外可见分光光度计扫描其水溶液的透光率(400～600 nm)。

1.3.7 COP、CM-COP和Ac-COP对透明质酸酶的抑制作用 取50 μL一定浓度的COP、CM-COP和Ac-COP，分别加入4.85 mL乙酸—乙酸钠溶液(pH 6.0，0.2 mo1/L)及50 μL 透明质酸酶(1 mg/mL)，充分摇匀，37 ℃下加入50 μL透明质酸钠(3.44 mg/mL)，反应15 min，加入2 mL 2.5%的CTAB(溶于2%氢氧化钠溶液)，15 min后，测定400 nm处吸光度A1，样品对照(缓冲液代替酶液)吸光度为AC1，空白对照(缓冲液代替酶液和样品溶液)吸光度为AC2，用缓冲液代替样品测吸光度A0[18]。按式(3)计算抑制率。

(3)

式中：

R——抑制率，%；

A1——样品吸光度；

AC1——样品对照(缓冲液代替酶液)吸光度；

AC2——空白对照(缓冲液代替酶液和样品溶液)吸光度；

A0——缓冲液代替样品吸光度。

1.3.8 数据处理 采用Excel 2016、Origin 2018、SPSS 25.0软件进行数据分析处理，P<0.05有显著性差异。所有试验均重复3次，结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 羧甲基化修饰单因素试验

2.1.1 NaOH浓度 由图1可知，当NaOH浓度<1.5 mol/L时，CM-COP取代度随NaOH浓度的升高而升高，但当NaOH浓度>1.5 mol/L时，CM-COP取代度开始下降。因此，NaOH浓度太高或太低，都会影响COP的羧甲基化效果。这可能是因为随着NaOH浓度的不断升高，由于空间位阻，使得COP溶胀得更为充分，与氯乙酸接触的机会也增多，醚化反应效率提高，从而使反应取代度增加。但溶液中NaOH过量，氯乙酸可能发生副反应，使其利用率降低，反而使取代度降低。因此，当NaOH浓度为1.5 mol/L时，取代度达最大0.665。

图1 NaOH浓度对CM-COP的影响

2.1.2 反应温度 由图2可知，当反应温度<60 ℃时，随着反应温度的不断升高，CM-COP的取代度逐渐升高，但当反应温度>60 ℃时，取代度呈下降趋势，说明适当提高反应温度有利于羧甲基的修饰，但温度过高不利于羧甲基的取代。这可能是因为温度不断升高，加快了分子运动速度，增加了分子间相互碰撞机会，致使多糖取代度增加。因此，选择反应温度60 ℃为宜。

图2 反应温度对CM-COP的影响

2.1.3 反应时间 由图3可知，当NaOH浓度和反应温度一定时，随着反应时间的延长，CM-COP取代度逐渐提高。当反应时间>3 h时，CM-COP的取代度反而有所降低，可能是因为当反应时间为1～3 h时，随着反应时间的延长，反应活性中心增多，醚化反应速率加快，因此CM-COP的取代度显著增加。当反应时间超过3 h后，可能其体系内副产物增多或不稳定，导致中间产物分解，造成取代度降低。因此，最佳反应时间为3 h，此时取代度为0.665。

图3 反应时间对CM-COP的影响

2.1.4 不同取代度CM-COP的制备 根据COP羧甲基化修饰单因素试验结果，调整反应条件，制备CM-COP-A、CM-COP-B、CM-COP-C、CM-COP-D 4种不同取代度的CM-COP，其羧甲基取代度及制备工艺见表1。

表1 CM-COP的制备条件及取代度

图4 COP及CM-COP的红外光谱图

2.1.6 羧甲基化多糖的溶解性 试验发现，在同浓度条件下，用氯乙酸法制得的CM-COP与COP相比，在加热或超声波等外界辅助条件下，溶解度均有不同程度的提高，其修饰产物在冷水中稍稍振荡即可溶解。由图5可知，同一浓度条件下，CM-COP水溶液的透光率明显高于COP溶液，说明羧甲基化修饰能提高其水溶性。

图5 COP及CM-COP水溶液的透光率

2.2 乙酰基化修饰单因素试验

2.2.1 乙酸酐用量 由图6可知，取代度随乙酸酐用量的增加而上升，可能是因为随着乙酸酐用量的增多，增加了COP乙酰化的反应几率，乙酰基取代度也随之增加。但当乙酸酐用量>3 mL时，COP乙酰基的取代度逐渐下降，可能是因为反应体系的pH值随乙酸酐的增加逐渐下降，增大了乙酸酐水解的副反应程度。因此适宜的乙酸酐用量为3 mL，此时取代度为0.400。

图6 乙酸酐用量对Ac-COP的影响

2.2.2 反应温度 由图7可知，一定程度的反应温度有利于COP的乙酰化修饰。当反应温度为30～60 ℃时，随反应温度升高，COP的乙酰基取代度几乎呈直线增加，可能是在一定温度范围内，温度越高，反应物活性越强，COP乙酰基取代度随之增大。但当反应温度>60 ℃时，乙酰基取代度快速下降，说明温度太高并不利于COP的乙酰化反应，可能是当反应温度>60 ℃时，乙酸酐的水解速度过快，导致COP乙酰基的取代度减小。

图7 反应温度对Ac-COP的影响

2.2.3 反应时间 由图8可知，当反应时间为1～3 h时，Ac-COP乙酰基的取代度随反应时间的延长而提高，3 h后，Ac-COP乙酰基的取代度随反应时间的延长而下降，可能是因为Ac-COP在体系中并不稳定，随着反应时间的延长，部分产物发生分解，引起乙酰化程度降低。因此，COP的乙酰化修饰的较佳反应时间应为3 h。

图8 反应时间对Ac-COP的影响

2.2.4 不同取代度Ac-COP的制备 根据对COP乙酰化修饰的3个影响因素的研究结果，调整反应条件，制备由低到高4种不同取代度的Ac-COP(Ac-COP-A、Ac-COP-B、Ac-COP-C、Ac-COP-D)，其乙酰基取代度及制备工艺见表2。

表2 Ac-COP的制备条件及取代度

图9 COP及Ac-COP的红外光谱图

2.2.6 乙酰化多糖的溶解性 由图10可知，同一浓度条件下，Ac-COP水溶液的透光率明显高于COP溶液，说明乙酰化修饰可明显提高COP在水溶液中的溶解性。

图10 COP及Ac-COP水溶液的透光率

2.3 COP、CM-COP和Ac-COP对透明质酸酶的抑制作用

2.3.1 羧甲基化修饰 由图11可知，COP和不同取代度的CM-COP均对透明质酸酶活性具有良好的抑制作用，且抑制能力有明显浓度依赖性，即随着样品浓度的增加其抑制率不断提高。当多糖质量浓度为1 mg/mL时，COP、CM-COP-A、CM-COP-B、CM-COP-C、CM-COP-D对透明质酸酶的抑制率分别为51.1%，53.3%，56.3%，61.3%，63.7%，与COP相比，不同取代度的CM-COP对透明质酸酶活性的抑制能力均有一定程度的提高，且随取代度的增加抑制率越大，说明COP的羧甲基化有利于增加COP的透明质酸酶抑制活性。这可能是羧甲基化后多糖内部结构发生改变，从而影响抑制透明质酸酶的活性，其具体机理有待深入研究。综上，不同取代度的CM-COP均有利于增强COP对透明质酸酶活性的抑制作用。

图11 COP及CM-COP对透明质酸酶的抑制作用

2.3.2 乙酰化修饰 由图12可知，COP及其不同取代度的Ac-COP均对透明质酸酶的活性抑制有明显作用。当多糖质量浓度为0.2～1.0 mg/mL时，COP、Ac-COP-A、Ac-COP-B、Ac-COP-C、Ac-COP-D对透明质酸酶活性的抑制率分别为50.9%，54.5%，58.3%，61.8%，65.3%。与COP相比，Ac-COP对透明质酸酶活性具有更好的抑制作用，且抑制能力有明显浓度依赖性。这可能是因为经乙酰化修饰后的Ac-COP中乙酰基含量增加，从而导致COP的空间结构发生变化，活性提高。综上，COP的乙酰化修饰有利于增加COP对透明质酸酶活性的抑制作用。

图12 COP及Ac-COP对透明质酸酶的抑制作用

3 结论

通过氢氧化钠—氯乙酸法和乙酸酐法分别探究了羧甲基化油茶籽粕多糖和乙酰化油茶籽粕多糖的修饰工艺。结果表明，羧甲基化油茶籽粕多糖的最佳修饰工艺条件为：NaOH浓度2 mol/L、反应温度60 ℃、反应时间3 h；乙酰化油茶籽粕多糖的最佳修饰工艺条件为：乙酸酐用量3 mL，反应温度60 ℃、反应时间3 h。油茶籽粕多糖及其两种修饰多糖均具有多糖的显著特征峰，3 413，2 930，1 611，1 420，1 323 cm-1等特殊峰值处均具有明显峰，表示羧甲基化修饰成功；3 413，2 930，1 724，1 247 cm-1等特殊峰值处均具有明显峰，表示乙酰化修饰成功。油茶糖、羧甲基化油茶籽粕多糖和乙酰化油茶籽粕多糖均对透明质酸酶活性具有良好的抑制作用，且抑制能力有明显浓度依赖性。后续将进一步探索羧甲基化及乙酰化油茶籽粕多糖在体内对于透明质酸酶的活性作用情况及作用机理。