异叶茴芹提取物药用功效的研究

董琼 李姣 刘永飞 杨光旭 胡媛媛 姜玉连 刘倩

异叶茴芹(Pimpinella diversifolia DC)隶属于伞形科(Apiaceae)芹亚科(Apioideae)茴芹属,为中国茴芹属中最为广布的一个种,又名山当归、苦爹菜［1］。异叶茴芹作为民间常用草药,常用于风寒感冒咳嗽、肺结核、痢疾等疾病的治疗,具有解毒消肿、活血散淤的功能,还具抗肿痛、抗结核作用和一定程度的抗炎、止血、凝血活性［2,3］。目前有关异叶茴芹药用功效的开发利用的研究较为少见,作者针对异叶茴芹提取物抗炎作用展开了实验研究。

1 材料与方法

1.1材料来源 TD5A-WS 离心机、RE-6000 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、FLUOstar Omega 多功能荧光酶标仪(BMG LABTECH)、FB224 电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、地塞米松磷酸钠注射液(山西省芮城科龙兽药有限公司,批号：20190602)、角叉菜胶(上海伊卡生物技术有限公司,批号：20191021)、超声清洗机(精密清洗机械有限公司)、异叶茴芹植株(采自浙江省温州市永嘉县枫林镇高塘村),SPF 级昆明种雌性小鼠(长沙市天勤生物技术有限公司,许可证号：SCXK 2014-0011),体重35～45 g。

1.2实验方法

1.2.1异叶茴芹粗提取物的功效研究

1.2.1.1异叶茴芹粗提物的制备 取异叶茴芹植株,干燥后切断,粉碎后过60 目筛。用电子天平称取5 g异叶茴芹粉末放入烧杯,加入体积分数60%乙醇溶液150 ml,在常温下浸泡3 h,温度为60 ℃,超声40 min,超声2 次,取烧杯中上清液。将取得的2 次上清液分别离心,再取离心管中上清液,装入烧杯中,用保鲜膜封住烧杯口,放入冰箱冷藏贮存。

1.2.1.2小鼠分组饲养 适应性饲养小鼠7 d 后,选取健康小鼠42 只,随机分为三组,标记为异叶茴芹提取物组、生理盐水对照组、地塞米松组,每组14 只。均饲养于15～20 ℃,相对湿度45%～55%的清洁环境中,使用标准饲料,自由摄食和饮水。

1.2.1.3小鼠足肿胀实验 参考已发表的文献［4,5］,小鼠分组给药连续7 d,小鼠灌胃剂量为0.2 ml/(次·只)。最后一次给药前禁食不禁水16 h,给药60 min 后于每只小鼠右后足腱膜下注射1%角叉菜胶0.04 ml,以左足为正常对照,致炎4 h 后,小鼠颈椎处脱臼处死,从小鼠膝关节处剪下左右两后足,精密电子分析天平称重。小鼠足肿胀度=右足重量(g)-左足重量(g),肿胀抑制率(%)=(空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100%。

1.2.1.4小鼠腹腔毛细血管通透性实验 参考已发表的文献［4,5］,最后一次给药后60 min,尾静脉注射0.25%伊文思蓝生理盐水液5 ml 后,立刻腹腔注射0.6%冰乙酸5 ml,15 min 后,颈椎脱臼处死小鼠,腹腔注射6 ml 生理盐水,轻摇小鼠腹部,剪开腹部皮毛,收集腹腔液,于3×103r/min 离心10 min,取上清液,用酶标仪于590 nm 处测定OD 值。

1.2.2不同药量异叶茴芹提取物的功效研究 将“1.2.1.1”中制备的异叶茴芹提取物溶液使用旋转蒸发仪旋蒸到溶液量<3 ml,再将所得溶液稀释至3、6、12 ml。生药量(g/ml)=投药量/溶液体积。另选56 只昆明种小鼠,随机分为高、中、低浓度组(总黄酮生药量分别为1.67、0.83、0.42 g/ml)和空白对照组(等体积的生理盐水),每组14 只。

1.2.2.1常压耐缺氧性研究 参考已发表的文献［6］,连续灌胃给药7 d,灌胃剂量为每只小鼠0.2 ml/次。把小鼠放入盛有5 g钠石灰的250 ml广口瓶中,加盖密封,以呼吸停止(小鼠胸部不起伏)为指标,记录小鼠死亡时间。

1.2.2.2免疫效果研究 于最后一次给药后24 h 对小鼠进行脱颈处死,称重记录后环切摘除小鼠的胸腺及脾脏,称重并记录,按照如下公式计算小鼠的脾脏指数及胸腺指数。脾脏指数=脾脏重量(mg)/小鼠称重(g)。胸腺指数=胸腺重量(mg)/小鼠称重(g)。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0 统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1异叶茴芹粗提物对角叉菜胶致小鼠足肿胀抑制率的影响 异叶茴芹提取物组和生理盐水组的肿胀度比较差异无统计学意义(P>0.05)；地塞米松组的肿胀度显著低于生理盐水组和异叶茴芹提取物组,差异具有统计学意义(P<0.05)；异叶茴芹提取物组肿胀抑制率显著低于地塞米松组,差异具有统计学意义(P<0.05)。表明异叶茴芹粗提物具有轻微的抗炎效果,但其有效成分浓度并不高,有待进一步纯化。见表1。

表1 异叶茴芹粗提物对角叉菜胶致小鼠足肿胀抑制率的影响(,%)

表1 异叶茴芹粗提物对角叉菜胶致小鼠足肿胀抑制率的影响(,%)

注：与地塞米松组比较,aP<0.05

2.2异叶茴芹粗提物对冰乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 地塞米松组OD 值低于生理盐水组,但比较差异无统计学意义(P>0.05)；异叶茴芹提取物组OD值高于生理盐水组,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明地塞米松对于冰乙酸所引起的小鼠腹腔毛血管通透性具有一定的抑制作用,而异叶茴芹粗提物未有抑制作用,且提高了冰乙酸所引起的毛细血管通透性,可能是异叶茴芹粗提物中某种成分具有一定的毒性。见表2。

表2 异叶茴芹粗提物对冰乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响()

表2 异叶茴芹粗提物对冰乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响()

注：与生理盐水组比较,aP<0.05

2.3异叶茴芹提取物对小鼠耐缺氧性的影响 中浓度组、低浓度组的死亡时间与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；高浓度组的死亡时间略高于空白对照组,但比较差异无统计学意义(P>0.05)。提示异叶茴芹中、低浓度剂量对提高小鼠的耐缺氧性均无明显效果,仅异叶茴芹高浓度有效,但效果甚微,可能是其含有的有效成分含量不高。见表3。

表3 异叶茴芹粗提物对小鼠耐缺氧性的影响(,min)

表3 异叶茴芹粗提物对小鼠耐缺氧性的影响(,min)

注：与空白对照组比较,aP>0.05

2.4异叶茴芹提取物对小鼠免疫功能的影响 中浓度组脾脏指数显著高于空白对照组、高浓度组、低浓度组,差异具有统计学意义(P<0.05),可能是因为在饲养过程中有小鼠打架受伤,导致脾脏指数增高。空白对照组脾脏指数显著低于高浓度组、中浓度组、低浓度组,差异具有统计学意义(P<0.05),说明异叶茴芹提取物对小鼠脾脏指数有一定的影响。在胸腺指数中,高浓度组小鼠的胸腺指数最高,其次为低浓度组、空白对照组,中浓度最低,但组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。说明不同浓度的异叶茴芹提取物对小鼠免疫功能的影响有所不同。见表4。

表4 异叶茴芹提取物对小鼠免疫功能的影响()

表4 异叶茴芹提取物对小鼠免疫功能的影响()

注：与空白对照组比较,aP<0.05；与中浓度组比较,bP<0.05

3 讨论

由本研究结果可知,异叶茴芹提取物在抑制角叉菜胶引起的小鼠足肿胀、提高小鼠耐缺氧性、提高小鼠免疫功能方面有一定的作用,但效果不显著。在冰乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性实验中异叶茴芹提取物未见有抑制效果,且产生了反作用,说明直接灌胃异叶茴芹提取物可能对小鼠的某些部位产生了不良影响,而引起了腹腔毛细血管通透性提高。因此,对于如何安全、有效地进一步开发利用异叶茴芹仍有待深入研究。

赵良辉等［7］研究发现,异叶茴芹总黄酮具有较好的体外抗氧化活性,在羟基自由基的清除上,异叶茴芹总黄酮优于同等浓度的Vc,在较低pH 值、一定的浓度和时间内,能够有效地清除亚硝酸钠,在pH 值=3.0时,异叶茴芹总黄酮在试验浓度范围内,能有效地抑制亚硝胺的合成。本研究在此基础上,展开了小鼠常压耐缺氧实验,但结果表明异叶茴芹提取物对小鼠耐缺氧能力的改善效果并不明显。黄酮类化合物在增强免疫功能等方面的作用有效［8］,灌胃给药异叶茴芹提取物的小鼠,其脾脏指数及胸腺指数并未出现显著变化,可能缘于给药时间需要进一步延长。已有的研究工作中［3］,异叶茴芹醇提物和异叶茴芹水提物均对二甲苯所致小鼠的耳廓肿胀度具有极为明显的影响,可以降低二甲苯致小鼠耳廓肿胀的程度。

综上所述,异叶茴芹提取物对角叉菜胶所引起的足肿胀有一定的抑制,但可能由于粗提物中化学成分复杂,有效的抗炎成分占比低,有必要提纯精制后再进行利用。