基于UPLC的不同产地野菊花多组分定量分析△

魏伟锋，韩正洲，魏民，李建领，张凯，姚慧颖，王信宏，*

1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；2.山东农业工程学院，山东 济南 250100；3.嘉应学院，广东 梅州 514031

野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥头状花序[1]，为清热解毒类中成药及相关制剂的主要原料，生长于草地、田野、路边等，在民间及临床上均应用广泛[2-4]。植物化学研究表明，野菊花主要含有黄酮类、萜类、绿原酸类、叶绿素、微量元素等化合物[5-7]。其发挥清热解毒功效的活性物质主要为黄酮类和有机酸类化合物[5,8-10]。蒙花苷、木犀草素、芹菜素和木犀草苷为黄酮类化合物中的主要代表性成分，具有抗炎、保肝、抗肿瘤、保护心血管系统、抗菌等多种药理作用。绿原酸为有机酸类化合物中的代表性成分，具有广谱抗菌、抗病毒、保肝、利胆、抗肿瘤、降血压、调血脂、清除自由基等多种药理活性[3,11-12]。

中药的药效是多种化学成分共同作用的结果，仅检测蒙花苷的含量不足以准确评价和比较不同产地野菊花的质量。本研究选取了39 份不同产地野菊花样品，建立了基于超高效液相色谱法（UPLC）的野菊花定量分析方法，同时对蒙花苷、木犀草素、芹菜素、木犀草苷和绿原酸5 个化合物进行定量分析，为野菊花的质量评价提供参考。

1 材料

1.1 试药

野菊花样品均为野生样品，初花期采收，晒干后保存，产区信息见表1，经华润三九医药股份有限公司韩正洲工程师鉴定为野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥头状花序，凭证样品存放于华润三九医药股份有限公司研发中心。

表1 野菊花样品来源信息

对照品绿原酸（纯度≥96.6%，批号：110753-201314）、木犀草苷（纯度≥94.9%，批号：111720-201609）、木犀草素（纯度≥99.6%，批号：111520-200504）、蒙花苷（纯度≥96.6%，批号：111528-201710）、芹菜素（纯度≥99.6%，批号：111901-201102）均购自中国食品药品检定研究院；色谱纯乙腈、甲醇均购自赛默飞世尔科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

ACQUITY UPLC H-Class 型超高效液相色谱系统（美国Waters 公司）；MF10B 型研磨机（德国IKA 公司）；ME36S 型百万分之一分析天平（德国Sartorius 公司）；XS204 型万分之一分析天平（瑞士Mettler toledo 公司）；SB-400DTY 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流动相：乙腈（A）-0.02%磷酸溶液（B）；梯度洗脱（0～10 min，10%～15%A；10～15 min，15%～25%A；15～30 min，25%～30%A；30～35 min，30%～10%A；35～37 min，10%A）；进样体积：2 µL；柱温：（30±5）℃；流速：0.4 mL·min-1；检测波长：326 nm。

2.2 供试品溶液制备

精密称定过三号筛（50 目）的干燥野菊花粉末0.2 g，置于100 mL 的具塞锥形瓶中，加入70% 甲醇50 mL，称定质量，超声提取30 min（功率：500 W，频率：40 kHz），放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，静置，吸取提取液，0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液[13]。

2.3 混合对照品溶液制备

精密称取对照品绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素适量，用甲醇溶解并定容至100 mL，得到质量浓度分别为11.82、20.35、11.11、39.68、10.00µg·mL-1的混合对照品溶液。精确吸取混合对照品 溶液0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL 于10 mL 量瓶中，用甲醇定容，即得系列质量浓度的混合对照品溶液。

2.4 系统适用性与线性关系考察

分别吸取2.3 项下的系列混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，5 个成分均能达到基线分离，与相邻色谱峰的分离度均大于2.0，以各成分色谱峰计算理论塔板数>2000，且峰形较好，典型的UPLC 色谱图见图1。以对照品质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，见表2。结果显示，5 个成分在相应的质量浓度范围内与峰面积的线性关系均良好（r≥0.999 0）。

图1 混合对照品与野菊花样品的UPLC图

表2 各化合物线性关系考察

2.5 精密度试验

精密称取野菊花混合样品0.2 g，按2.2 项下方法处理，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素峰面积RSD 分别为0.97%、1.39%、0.65%、1.78%、1.19%，均低于2.0%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取野菊花混合样品0.2 g，按2.2 项下方法平行制备6 份，按照2.1 项下色谱条件进行UPLC分析，记录峰面积，绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素峰面积的RSD 分别为1.67%、1.77%、1.82%、1.06%、1.98%，均小于2.0%，表明方法具有良好的重现性。

2.7 稳定性试验

精密称取野菊花混合样品0.2 g，按2.2 项下方法处理，按照2.1 项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24、48 h 测定，记录峰面积，计算绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素峰面积RSD分别为1.74%、0.49%、0.13%、1.15%、1.36%，均小于2.0%，表明供试品溶液中的5 个成分在室温条件下48 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的野菊花样品粉末6 份，精密称定0.1 g，按2.2 项下方法处理，分别精密加入一定量的绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素对照品溶液，按2.1 项下色谱条件下进样，记录峰面积，计算其加样回收率，结果见表3，加样回收率为99.01～99.82%，RSD最高为1.35%。

表3 野菊花5个成分加样回收率试验结果

2.9 5个成分的定量测定

将39 批野菊花样品按2.2 项下方法处理，每个批次平行3 份，在2.1 项下色谱条件下进行定量测定，计算各供试品中5 个成分的含量，结果见表4。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版规定野菊花中蒙花苷质量分数不得低于0.8%。实验结果表明，39 份野菊花样品中有23 份未达到合格水平，其中广东（7、8 号）、广西（11、13 号）、湖北（29、33 号）、重庆（35、36 号）、河南（15 号）地区9 份样品未检测到蒙花苷；湖北随州样品（24 号）绿原酸质量分数最高，为5.40 mg·g-1，湖北宜昌样品（27 号）绿原酸质量分数最低，为0.30 mg·g-1；湖北双牌野菊花样品（38 号）木犀草苷质量分数最高，为2.80 mg·g-1，广西南丹样品（12 号）木犀草苷质量分数最低，为0.10 mg·g-1；湖南益阳样品（39 号）木犀草素质量分数最高，为11.90 mg·g-1，湖北随州样品（22、24号）木犀草素质量分数最低，为0.60 mg·g-1；湖北监利样品（28 号）芹菜素质量分数最高，为1.10 mg·g-1，河南汝州（16 号）、河南焦作（17 号）、湖南双牌（38 号）3 份样品中未检测到芹菜素。

表4 野菊花5个成分含量测定结果 mg·g-1

3 分析

3.1 UPLC方法学研究

UPLC 具有高分离度、高灵敏度、洗脱时间短等优点[14-17]。谭晓杰等[18]建立了HPLC 测定野菊花蒙花苷的方法，检测波长选择326 nm；崔兰冲等[19]研究了超声提取野菊花组分的方法。在前人研究的基础上，本研究选择了70%的乙醇超声提取30 min 的样品处理方法，采用ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 µm）色谱柱，乙腈-0.02%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，流速为0.4 mL·min-1，柱温为（30±5）℃，进样体积为2µL，检测波长为326 nm。在此条件下，5 个成分线性关系良好，精密度、稳定性、重复性及加样回收率试验结果表明，此方法可以用于野菊花定量分析。

3.2 不同产地野菊花定量分析

本研究对39 批次野生野菊花进行了定量分析，绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素质量分数分别为0.30～5.40、0.10～2.80、0～15.40、0.60～11.90、0～1.10 mg·g-1。说明不同产地野生野菊花各成分含量差异显著，质量参差不齐。建立合理、有效的中药质量评价体系是实现中药现代化的前提之一，本研究的野菊花样品，按《中国药典》2020 年版规定[1]，合格率仅为41.0%，同时有9 份样品未检测到蒙花苷。谭晓杰等[18]、崔兰冲等[19]的研究中也检测到大量不合格样品。多种证据表明仅以蒙花苷含量判定野菊花药材质量不够全面，仍需深入探讨。